Μηχανήματα Λειτουργικής Γονιδιωματικής (2) / Διάλεξη 23 / Λειτουργική Γονιδιωματική - Εισαγωγή, Μηχανήματα αλληλούχισης πρώτης γενιάς, Μηχανήματα αλληλούχισης δεύτερης γενιάς, Μηχανήματα αλληλούχισης τρίτης γενιάς, Σύγκριση Μηχανημάτων αλληλούχισης, Συστοιχίες DNA, Φασματογράφος μαζών - Τριανταφυλλίδης Αλέξανδρος (ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ, 2014)
Λειτουργική Γονιδιωματική - Εισαγωγή, Μηχανήματα αλληλούχισης πρώτης γενιάς, Μηχανήματα αλληλούχισης δεύτερης γενιάς, Μηχανήματα αλληλούχισης τρίτης γενιάς, Σύγκριση Μηχανημάτων αλληλούχισης, Συστοιχίες DNA, Φασματογράφος μαζών: Λοιπόν, καλημέρα. Σήμερα έχουμε να συνεχίσουμε και να συζητήσουμε και άλλα κομμάτια όσον αφορά μηχανήματα, τα οποία μας βοηθάνε στη λειτουργική εγγόνια ιδιωματική. Συζητήσαμε χθες, και στο προηγούμενο μάθημα και στο προηγούμενο μάθημα σχετικά με μηχανήματα αλληλούχησης νέας γενιάς και πώς αυτά τα μηχανήματα μπορούν να βοηθήσουν στο αμέσως επόμενο μάθημα θα αρχίσουν να βλέπουν και εφαρμογές σε αυτών των μηχανημάτων. Και σήμερα έχουμε να μιλήσουμε για τα άλλα δύο σημαντικά μηχανήματα, τις μικρές συστηχίες, τις συστηχίες DNA, καθώς και τα μηχανήματα αφασματογράφου μαζών και πώς αυτά μπορούμε να τα χρησιμοποιήσουμε για λειτουργική εγγόνια ιδιωματική. Οι συστηχίες DNA γενικά είναι διαδικασίες στις οποίες βασίζονται σε υβρετισμό DNA. Έτσι λοιπόν αυτό το οποίο χρειάζεται να κάνουμε είναι από τη μία να έχουμε ένα υπόστρωμα πάνω στο οποίο έχουμε στερεώσει αριθμό τμήμα των DNA είτε μεγάλα κομμάτια, είτε λίγο πιο μικρά, είτε ολίγο νουκλωτήδι, από όταν αντίστοιχα έχουμε μάκρες συστηχίες, μικρές συστηχίες, και ολίγο νουκλωτήδικες συστηχίες και από την άλλη φέρνουμε το δικό μας το DNA το οποίο θέλουμε να το ελέγξουμε και θέλουμε να το υβρετισσούμε. Ανάλογα με τον υβρετισμό που θα πάρουμε και ανάλογα με το σήμα το οποίο θα πάρουμε μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε τις συστηχίες για ποιοτικές και για ίμι ποσοτικές αναλύσεις. Αυτό είναι στο σύνολο τι είναι οι συστηχίες, θα το δούμε και λίγο πιο αναλυτικά τώρα. Στις μάκρες συστηχίες οι οποίες είναι πιο παλιές, χρησιμοποιώνται σαν πιο παλιά, τώρα πια δεν χρησιμοποιούνται τόσο πολύ, το βασικό είναι ότι το υπόστρωμά μας πάνω στο οποίο στερεώνουμε το DNA μας είναι συνήθως νάιλον μεμβράνες και από εκεί πέρα για να δούμε το αποτέλεσμα του υβρετισμού γίνεται συνήθως με αυτοδιογραφία. Καταλαβαίνετε λοιπόν ότι είναι τεχνικές οι οποίες ήταν λίγο πιο παλιές. Απλώς το καλό ήταν ότι ήταν ευθυνές σχετικά οπότε μπορείς να χρησιμοποιήσουμε πιο παλιά. Εδώ βλέπετε ας πούμε ότι μπορούμε να έχουμε μια νάιλον μεμβράνη πάνω στην οποία μπορούμε να στερεώσουμε 100 διαφορετικές αλληλουχίες DNA και πάνω στις οποίες μετά θα πάμε να κάνουμε έλεγχο σε αυτές τις 100 αλληλουχίες να δούμε κατά πόσο υβρετίζεται το DNA το οποίο θέλουμε να ελέγξουμε. Το καταλάβουμε και καλύτερα όταν μπούμε στις μικρούς συστηχίες. Στις μικρούς συστηχίες πια αρχίζουμε και μπαίνουμε σε αυτές καθαυτές τα μηχανήματα τα οποία χρησιμοποιούνται σήμερα και εκτενώς σε πάρα πολλές εφαρμογές. Για μικρούς συστηχίες έχετε ακούσει, πέρα από εμένα που σας έχω πει κατά καιρούς, σε καταστήμα στην γενετική ανθρώπου, έχετε ακούσει κάποια πράγματα. Στις μικρούς συστηχίες λοιπόν αυτό που θέλουμε είναι, χρειάζεται να στερεώσουμε το DNA μας σε ένα γυάλινο slidey chip. Εδώ φαίνεται ακριβώς ο τρόπος με τον οποίο μπορούμε να στερεώσουμε το DNA μας, το οποίο θα είναι ο ανοιχνευτής για να μπορέσουμε να ελέγξουμε την έκφραση διαφόρων γωνιδίων. Έτσι λοιπόν επάνω σε ένα τέτοιο slide, το οποίο γενικά το μέγεθος του δεν είναι παραπάνω από τόσο, μπορούμε να στερεώσουμε λάθος πάνω από 5.000 μέχρι και 40.000 διαφορετικά προϊόντα PCR, που να μπορείς να στερεώσεις εκεί πέρα όλα τα γωνίδια ενός οργανισμού, στο συγκεκριμένο περίπτωση μπορώ να πω όλα τα γωνίδια της ίμης. Αυτό τι σημαίνει, ότι έχουμε έναν τρόπο, όπου έχουμε όλα τα γωνίδια που ξέρουμε, πάνω στα οποία να μπορούμε να ελέγξουμε μετά ποια από αυτά τα γωνίδια εκφράζονται. Για να το κάνουμε αυτό, χρειάζεται να χρησιμοποιήσουμε το DNA ή πιο σωστά το RNA από τα δείγματα τα οποία θέλουμε να ελέγξουμε. Βλέπουμε συνολικά όλη τη διαδικασία, θα τη δούμε και με βιντεάκι, θα τη δούμε και αναλυτικά με διαφάνειες. Παίρνουμε αρχικά τους κλόνους του DNA, τους οποίους θέλουμε να στερεώσουμε, τους ενισχύουμε με PCR και τους τοποθετούμε σε τσίπ ρομποτικά, οπότε μετά έχουμε έτοιμο το τσίπ μας. Αυτό το τσίπ που είναι στερεωμένο, όλα τα γωνίδια τα οποία μας ενδιαφέρουν, θα έρθουμε να ελέγξουμε τελικά τι εκφράζεται και τι δεν εκφράζεται από διαφορετικούς οργανισμούς. Έτσι λοιπόν έχουμε το δείγμα το οποίο θέλουμε να ελέγξουμε τι εκφράζεται, ένα κοντρόλ που πάντα χρειαζόμαστε ένα κοντρόλ και με την ακομονώνουμε RNA κάνουμε ανάστραφη μεταγραφή, παίρνουμε το cDNA, το επισημαίνουμε διαφορετικές χρωστικές και μετά πάμε να κάνουμε υβριδισμό. Ανάλογα με τον υβριδισμό που θα πάρουμε και τα αποτελέσματα, μπορούμε να δούμε και τελικά το τι γίνεται από εκεί και πέρα. Έτσι λοιπόν τι μπορούμε να κάνουμε, έχετε συζητήσει καθόλου ακριβώς πώς δουλεύει αυτό ή όχι, όχι, ωραία. Άρα λοιπόν τι μπορούμε να κάνουμε, μπορούμε να πάρουμε για παράδειγμα δύο διαφορετικά δείγματα cDNA-RNA, για παράδειγμα από ένα κανονικό και ένα καρκινικό κύτταρο. Και θα θέλουμε να ελέγξουμε ποια είναι αυτά τα γωνίδια τα οποία εκφράζονται στο καρκινικό κύτταρο σε σχέση με το κανονικό κύτταρο. Θα ελέγξουμε δηλαδή γωνίδια τα οποία εκφράζονται περισσότερο ή γωνίδια τα οποία εκφράζονται και λιγότερο. Γιατί έχει σημασία και αυτό, δεν έχει σημασία μόνο η υπερέκφραση, έχει σημασία και η υποέκφραση γωνιδίων. Πέρα από αυτές τις δύο διαφορετικές κυταρικές καταστάσεις μπορούμε να θελήσουμε να πάρουμε δύο διαφορετικές χρονικές στιγμές. Τι γωνίδια εκφράζονται στη λάρβα της ροσόφυλλα, τι γωνίδια εκφράζονται σε ένα όρημα άτομο. Μπορεί να θέλουμε να ελέγξουμε δύο διαφορετικές καταστάσεις του στυλ, τι γωνίδια εκφράζονται σε κανονικές συνθήκες ή σε heat shock και ούτω καθεξής. Έτσι λοιπόν μπορούμε να συγκρίνουμε διαφορετικούς οργανισμούς, διαφορετικούς ιστούς, πολλά διαφορετικές καταστάσεις. Αυτό που θέλουμε είναι, εφόσον το επισημάνουμε διαφορετική χρωστική και μετά δούμε την ποσότητα του φορησμού που βγαίνει όταν χρησιμοποιήσουμε το laser, μπορούμε να ελέγξουμε το επίπεδο έκφρασης των γωνιδίων και να έχουμε μια ή μη ποσοτική μέτρηση. Δεν είναι εντελώς ποσοτικές συμμετρήσεις των μικροσυστυχιών. Αυτό που κάνουμε συνήθως είναι το δείγμα το οποίο θέλουμε να ελέγξουμε, το οποίο επισημαίνουμε με ευθορισμό κάνουμε το cDNA με ευθορισμό με κόκκινες χρωστικές, ενώ το δείγμα το οποίο είναι το κοντρόλ μας το κάνουμε πράσινη χρωστική. Έστω, ας το δούμε καλύτερα, έχει ένα βίντεάκι. Αυτό που θέλουμε να δούμε είναι δύο διαφορετικά φυτικά κύταρα. Θα νομίζω ότι θα μπορέσουμε να το δούμε σε λίγο. Έχουμε δύο διαφορετικά κύταρα, στο ένα έχουμε μολίνι με ΥΟ και σε κάποιο άλλο χωρίς ΥΟ. Παίρνουμε το RNA, το οποίο μετά το κάνουμε cDNA. Εδώ επισημαίνουμε κόκκινη χρωστική, εδώ με πράσινο. Από τη στιγμή που έχουμε πάρει το RNA από αυτά τα διαφορετικά κύταρα και τα έχουμε επισημάνει με διαφορετικές χρωστικές, δεν υπάρχει πια ανάγκη να τα έχουμε ξεχωριστά, μπορούμε πια να τα βάλουμε μαζί. Άρα λοιπόν αυτή τη στιγμή θα τα ενώσουμε. Έχουμε ένα cDNA λοιπόν, το οποίο είναι και από τη μια και από την άλλη περίπτωση, με διαφορετική χρωστική επισημασμένο. Και μπορούμε πια να το βάλουμε να υβριδιστεί πάνω στο τσίπ μας, τη μικροστιχία. Τώρα, ανάλογα με το γονίδιο που έχει εκφραστεί ή δεν έχει εκφραστεί ή έχει εκφραστεί και στους δυο ιστούς, θα πάρουμε διαφορετικούς υβριδισμούς. Εδώ πέρα προφανώς που έχουμε σε αυτό το σήμα υβριδισμού με αυτό το κόκκινο cDNA, σε τι αντιστοιχεί αυτό? Σε γονίδιο, το οποίο εκφράζεται μόνο σε αυτή την κατάσταση. Εντάξει, άρα λοιπόν στο συγκεκριμένο φυτικό κύτερο, γιατί είπαμε το κόκκινο αντιστοιχεί σε cDNA από RNA από φυτικό κύτερο, το οποίο μολύνθηκε με κάποιον ιό. Άρα λοιπόν το κύτερο όταν μολύνεται με αυτόν τον ιό, εκφράζεται κάποιο RNA, δεν ξέρουμε τώρα τι RNA είναι. Αυτό το RNA λοιπόν μετά μπορούμε να το ελέγξουμε επειδή ακριβώς υπάρχει το RNA εδώ πέρα και θα πάει και θα ευριστεί σε αυτό το σημείο. Εδώ πέρα τι βλέπουμε? Έχουμε RNA που αντιστοιχεί σε κανονικό κύτερο. Τι σημαίνει εδώ αυτό, μας ενδιαφέρει αυτό το γονίδιο ή δεν μας ενδιαφέρει αυτό το γονίδιο? Μας ενδιαφέρει, γιατί εκφραζόταν κανονικά σε κανονικό κύτερο και όταν μολύναμε με τον ιό, σταματάει να εκφράζεται. Άρα έχει σημασία και η υποέκφραση αυτού του γονιδίου. Και εδώ πέρα έχουμε μια άλλη περιοχή όπου έχουμε κάποιο γονίδιο που το RNA εκφράζεται και στη μια περίπτωση και στην άλλη περίπτωση. Αυτό τι σημαίνει, γιατί αυτό το γονίδιο δεν έχει καμία σημασία όσον αφορά τη μόλυση. Γιατί εφόσον εκφράζεται έτσι ή κι αλλιώς, δεν παίζει ρόλο στα μονοπάτια αυτά που έχουν να κάνουν για αντίσταση ή με την προσπάθεια του κυτάρου να αντέξει αυτόν τον ιό. Εντάξει, το καταλάβατε? Αυτό είναι, δεν έχει τίποτα άλλο. Από τη μία έχουμε θέσεις στις οποίες παίρνουμε σήμα κόκκινο, που αντιστοιχεί σε γονίδια που εκφράζονται στη συγκεκριμένη κατάσταση. Από την άλλη έχουμε θέσεις στις οποίες έχουμε σήμα πράσινο, που αντιστοιχεί σε γονίδια που σταματάνε να εκφράζονται στην κατάσταση που μας ενδιαφέρει. Άρα επίσης μας ενδιαφέρουν και αυτά τα γονίδια και εκφράζονται μόνο σε κανονική κατάσταση. Και αυτό μας ενδιαφέρει. Και επίσης υπάρχουν και γονίδια, τα οποία εκφράζονται έτσι κι αλλιώς. Αυτά δεν μας ενδιαφέρουν. Και επίσης, τι άλλο υπάρχουνε. Μπορεί να υπάρχουν και γονίδια, ας πούμε πως εδώ πέρα, που δεν εκφράζονται καθόλου, ούτε στη μια κατάσταση, ούτε στην άλλη κατάσταση. Μπορεί να εκφράζει σε κάποιον άλλο ιστό, σε κάποια άλλη χρονική στιγμή, ούτε και αυτά μας ενδιαφέρουν. Εδώ πέρα λοιπόν να δούμε τώρα τι θα γίνει. Θα ευρυδιστεί λοιπόν μόνο εκείνοι που αντιστοιχούν τα γονίδια που εκφράστηκαν σε αυτή την κατάσταση. Δείτε το λίγο, το βλέπετε πόσο μικρό είναι αυτό. Δυστυχώς είχα κάτω στο εργαστήριο και ξέχασα να φέρω. Να δώσω τα πραγματάκια είναι το τσιπ της μικροσυντυχίας. Το βάζεις, περνάει ο σκάνερ. Και αυτό παίρνουμε θέσεις πράσινες, θέσεις κόκκινες, θέσεις κίτρινες και θέσεις χωρισίμα. Οι κίτρινες είναι οι βρετισμούς και από τα δύο. Οι κόκκινες είναι οι βρετισμούς από το δείγμα ελέγχου. Και το άλλο, οι πράσινες είναι από το δείγμα κοντρόλ. Έγινε. Λίγο εδώ πέρα να προσέξετε. Σε κάθε θέσεις του τσιπ δεν υπάρχει μόνο ένα αντίγραφο του γονιδίου που μας ενδιαφέρει. Υπάρχουν πολλά αντίγραφα. Δηλαδή εδώ πέρα μπορούν να έχουμε βάλει εκατοντάδες ή και χιλιάδες αντίγραφα. Γι' αυτό και είναι μοιποσοτικό αυτή η έκφραση. Εδώ πέρα μπορεί να είχαμε εκφρασμένα χιλιά μόρια RNA αυτού του γονιδίου. Οπότε να πάνε και τα χιλιά μόρια RNA να υβριστούν εδώ. Και σε αυτή τη θέση που είναι ένα άλλο γονίδιο μπορεί να εκφράστηκαν εκατό μόρια αυτού του γονιδίου. Άρα λοιπόν το σήμα το κόκκινο εδώ πέρα θα είναι πιο έντονο με αυτό. Και θα μας δώσει και μια μοιποσοτική έκφραση. Έγινε? Άρα πρέπει να πάρουμε το πηλίκο να δούμε ποια είναι αυτά που εκφράζονται. Και μπορούμε να καταλάβουμε τελικά ποια γονίδια εκφράζονται. Αυτό είναι οι μικροσυστηχείες. Ποια είναι η βασική διαδικασία πάνω στην οποία εστηρίζονται οι μικροσυστηχείες. Το νυμβριδισμό. Αυτό είναι. Εντάξει. Από τον νυμβριδισμό εξαρτώνται όλα. Άρα λοιπόν. Όταν και τα δύο εδείγματα υβριδίζονται σε μια θέση παράγεται κύτωνο χρώμα. Το κόκκινο χρώμα υποδηλώνει MRNA ή αντίστοιχα CDNA υπερεκφρασμένος στο καρκινικό κύτωρο. Και το πράσινο MRNA ή CDNA υπερεκφρασμένος σε κανονικό κύτωρο. Και αντιστρόφισα να μας σκεφτούμε υποεκφρασμένος στο κύτωρο το οποίο μας ενδιαφέρει. Και αυτό έχει σημασία. Εδώ ακριβώς αυτό που θέλω να δείτε είναι ότι δεν υπάρχει μόνο ένα μόριο το οποίο το έχουμε στερεώσει εκεί πέρα. Υπάρχουν πολλά μόρια γι' αυτό και μπορούμε να πάρουμε υποστοτικές μετρήσεις. Άμα το δούμε στα γρήγορα. Πέρα από βίντεο αρχικά στερεώνουμε τα CDNA μας, ξεχωριστά CDNA σε ξεχωριστά γονίδια. Μετά προετοιμάζουμε το MRNA αναφοράς και το RNA μελέτης κόκκινο και πράσινο. Μετά κάνουμε, το πιο σημαντικό επίσης εδώ πέρα και αυτό είναι από τα πιο κρίσιμα στάδια στη μικροσυστηχία, είναι το ότι όταν πας να κάνεις συμβριδισμό δεν θα πάρεις τυχαία MRNA από τη μια περίπτωση και τυχαία MRNA από το άλλο το κύτωρο. Γιατί σκεφτείτε να πάρεις ας πούμε να απομονώσεις MRNA από 100 κύτταρα κανονικά και από 1000 κύτταρα μολυσμένα. Οι ποσότητες MRNA που θα απομονώσεις από τη μια και την άλλη περίπτωση δεν είναι ίσες. Άρα, λοιπόν, άμα πας να κάνεις σύγκριση μεταξύ δύο ανώμιων πραγμάτων θα βγάλεις λάθος αποτελέσματα. Άρα, γι' αυτό, ένα από τα πιο σημαντικά και τα πιο ευαίσθητα σημεία της τεχνικής είναι να βάλεις ίσες ποσότητες. Πες του, Ερακλή. Εγώ δεν καταλαβαίνω, γιατί αφού το αποτέλεσμα είναι χρωματική αντίξη, ποιο είναι το ποσοτικό. Ήμι ποσοτική είναι. Ναι. Όχι, ναι. Ναι, αλλά θα βγάλει διαφορετική ποσότητα χρώμα. Τους δέσεις εδώ πέρα. Είπαμε, αυτό είναι το πιο σημαντικό, ότι σε κάθε θέση που αντισχύσεις διαφορετικό γονίδιο, δεν υπάρχει ένα μόριο του γονιδίου το οποίο θες να ελέγξεις. Υπάρχουν πολλά μόρια στερεωμένα εκεί πέρα. Άρα λοιπόν υπάρχουν πολλές δυνατότητες να πάνε όσο περισσότερα μόρια έχουμε RNA, τόσο σε περισσότερα τέτοια σημεία θα πάνε και θα ευρυδιστούν. Αν έχεις χίλια μόρια που έχουν παραχθεί από το κύτταρό σου, θα μπορέσουν να ευρυδιστούν και τα χίλια εδώ πέρα. Εδώ πέρα που έχεις αντίστοιχα χίλια μόρια του άλλου γονιδίου, άμα το RNA δεν έχει εκφραστεί σε χίλια μόρια, αλλά έχεις 100 μόρια, τότε προφανώς εδώ θα έχεις ευρυδισμό από 100 μόρια, εδώ έχεις ευρυδισμό από 1000 μόρια και άρα θα πάρεις διαφορετικό σήμα. Ναι μεν θα πάρεις κόκκινο και κόκκινο, αλλά πέρα θα είναι πολύ πιο κόκκινο οφθορισμός και εδώ θα είναι πολύ λιγότερος οφθορισμός. Κατάλαβες, γι' αυτό. Άρα λοιπόν και αντίστοιχα αν θες να συγκρίνεις πράσινα και κόκκινα να τα πω έτσι, πρέπει εξ αρχής να ξεκινήσεις με την ίδια ποσότητα RNA για να μπορείς να κάνεις σωστές συγκρίσεις. Βάζεις λοιπόν τις ποσότητες, χρησιμοποιείς το laser και βλέπεις τα αποτελέσματα και βλέπεις κάτι τέτοιο. Άρα αυτό είναι, όπως είπαμε, με αυτή τη λογική δουλεύεις, θέλει βέβαια μια κάποια εξειδίκευση και μια κάποια εκπαίδευση, θέλει βέβαια σε όλο αυτό. Όσο περνάνε ο καιρός όμως, πια τα μάικρο αρέης είναι αρκετά στάνταρ ρουτίνα για ένα εργαστήριο ημωριακής βιολογίας. Και επίσης οι βιοπληροφορικές αναλύσεις αυτών των αποτελεσμάτων, επειδή πέρα από τα εργαστήρια τα οποία κάνουν καθαρά ερευνητική δουλειά, επιστημονική, για ανθρώπους, για ασθένειες κτλ, για καρκίνους, είναι σχετικά στανταρισμένα αυτά τα πράγματα. Υπάρχουν και στανταρισμένα software, τα οποία θα σου δώσουν κάποια αποτελέσματα. Αλλά άμα θέλεις να κάνεις σωστή δουλειά, το πιο σημαντικό, όπως έχουμε πει πάρα πολλές φορές, είναι το βιολικό σου ερώτημα. Τι θέλεις να ελέγξεις. Και άμα θες να το ελέγξεις, πώς ακριβώς θα το σχεδιάσεις σωστά το πείραμα για να πάρεις σωστά αποτελέσματα. Θα κάνεις το πείραμά σου, θα πάρεις την επεξεργασία της εικόνας, πρέπει πάλι να δεις ότι έχεις σωστά ισοκατανεμημένα αποτελέσματα και μετά θα προσπαθείς να πάρεις κάποια αποτελέσματα. Και μετά θα χρειαστεί να επαληθεύσεις τα αποτελέσματα σου. Τι κάνεις λοιπόν, θα το πούμε σε λίγο. Μικροσυστηχείες βλέπετε έτσι ακριβώς φαίνονται. Για παράδειγμα, πώς μπορούμε να το δούμε. Εδώ πέρα βλέπετε πώς το κάναμε παλιά και εδώ πέρα πώς μπορούμε να το κάνουμε πια. Δηλαδή, εδώ πέρα έχουμε κάποια καρκινικά κύτρα, τα οποία δεν έχουμε επιδράσει με κάποιον παράγοντα, χημειοθεραπεία, δεν ξέρω τι. Ενώ εδώ πέρα έχουμε κάνει χημειοθεραπεία. Βλέπετε ότι με την αυτορροδιογραφία φαίνεται ότι υπάρχουν διαφορές σε κάποιες περιπτώσεις. Πού υπάρχουν αυτές οι διαφορές? Κάπου να βρω. Να, να το. Βλέπετε ας πούμε αυτό εδώ πέρα. Στις σχέσεις με εδώ πέρα, εδώ πέρα, ήδη με το μάτι φαίνεται ότι υπάρχει διαφορά. Άρα, αν αυτό το κάνουμε σε τσιπ, σε μάικρο αρέι, θα μπορούσαμε ίσως να ξέρουμε εξ αρχής ποιο είναι αυτό το γωνίδιο και να μπορέσουμε τελικά να ελέγξουμε τι γίνεται, γιατί αυτό το γωνίδιο σε ποιο μονοπάτι συμμετέχει και να καπάρουν κάποιες περισσότερες πληροφορίες. Άρα, με αυτό τον τρόπο μπορούμε να κάνουμε και να ελέγξουμε πολλά γωνίδια. Τι είναι αυτό που μας δίνουν μικροσυστηχείες και θα το δούμε σε λίγο αμέσως. Έχουμε τη δυνατότητα να σκανάρουμε το σύνολο των γωνιδίων που υποθετικά μπορούν να εκφραστούν σε ένα οργανισμό. Και έτσι λοιπόν να βρούμε την σχετική έκφραση γωνιδίων. Αυτό μας δίνει τη δυνατότητα. Τώρα συζητήσαμε κυρίως τη δομική γωνιδιωματική. Εδώ πια αρχίζουμε και μπαίνουμε στο ποια γωνίδια εκφράζονται. Άρα λοιπόν μιλάμε για λειτουργική γωνιδιωματική. Και μπορούμε ίσως, εκείνο το στόχος μας, αν και ακόμα δεν έχουμε φτάσει και τόσο καλά σε αυτό το πράγμα, να αρχίσουμε να καταλαβαίνουμε. Σκεφτείτε ένα ποιο είναι το πιο σημαντικό πρόβλημα στον καρκίνο. Οι λεγόμενοι καρκίνικοι δείκτες. Δηλαδή, κατά πόσο μπορούμε να ελέγξουμε την πορεία μιας ασθένειας. Μπορούμε να κάνουμε πρόγνωση ότι κάποιος άνθρωπος θα εμφανίσει καρκίνο, όχι μόνο με βάση το DNA του, αλλά και με βάση το προφίλ των κυτάρων του. Μήπως αρχίζουν και εκφράζονται κάποια γωνίδια και μπορούμε να το ελέγξουμε εμείς αυτό το πράγμα πριν εμφανιστεί, πριν προχωρήσει πάρα πολύ ο καρκίνος. Άντε και εμφάνισε καρκίνο κάποιος άτομο. Μπορούμε, αφού κάνουμε χειμιοθεραπείες, να κάνουμε μια πρόβλεψη ότι η χειμιοθεραπεία έχει πάει καλά ώστε δεν θα ξαναεμφανίσει καρκίνο. Ο μόνος τρόπος να το κάνουμε αυτό ήταν με συλλογόμενους καρκίνικους δείκτες. Αλλά οι καρκίνικοι δείκτες, όσο ξέρετε, μακάρι να μην ξέρετε, για να μην χρειάσεις και ποτέ να ασχοληθείτε με αυτό, δεν μας δίνουν καλή εικόνα σε περισσότερες φορές. Άνια θα μπορέσει να βρεις, κάνεις, ας πούμε, το PSA για καρκίνοπροστάτη. Δεν είναι και ο καλύτερος καρκίνικος δείκτες, που είναι πρωτεΐνες. Το θέμα είναι να μπορέσουμε, αν δεν βλέπουμε κάποιες πρωτεΐνες, να πάμε στο επίπεδο της έκφρασης των γονιδίων. Άρα λοιπόν, εφόσον βρούμε την έκφραση, άμα δούμε πώς πάει η έκφραση και άμα συσχετίσουμε προφίλ έκφρασης γονιδίων με την πορεία του καρκίνου, με την πορεία της χημιοθεραπείας, ίσως να μπορούμε να δώσουμε καλύτερη θεραπεία, καλύτερη παρακολούθηση, όλα αυτά. Αλλά αυτός είναι ο στόχος μας. Πάντως, ακόμα και αυτά τα μηχανήματα ακόμα δεν έχουν μπορέσει να μας δώσουν την τέλεια εικόνα. Θέλουμε ακόμα περισσότερη δουλειά. Αυτό ακριβώς λέμε, ότι υποθετικά θα μπορούμε να συσχετίσουμε, ανάλογα με το προφίλ. Βλέπετε εδώ πέρα ότι θα κάνουμε χημιοθεραπεία σε διαφορετικά άτομα και βλέπουμε σε ποιες περιπτώσεις χημιοθεραπείας δεν πέτυχαν, σε ποιες περιπτώσεις χημιοθεραπείας πέτυχαν. Θα κάνουμε σύγκριση των διαφορετικών προφίλ που έχουμε στη μια περίπτωση και στην άλλη περίπτωση και θα δούμε, α, υπάρχει αυτό το γονίδιο που πάντα εκφράζεται σε άτομα τα οποία τελικά αντιδρούνε καλά στη χημιοθεραπεία, ενώ δεν εκφράζεται εδώ πέρα. Άρα είναι ένας δείκτης που πολύ πιο εύκολα θα μπορούμε να ελέξουμε σε ένα οποιοδήποτε άτομο στο μέλλον και να δούμε με βάση αυτό το προφίλ, αυτό το γονίδιο, φαίνεται ότι δεν αξίζει να κάνουμε τέτοια χημιοθεραπεία σε αυτό το άτομο, καλύτερα να κάνουμε κάποια άλλη θεραπεία. Αυτός είναι ο στόχος μας. Αυτό το οποίο θέλουμε, αυτό που παίρνουμε από τα μικροσυστηχείς, είναι κάτι τέτοιο κάποιες φορές. Δηλαδή βλέπετε ότι αυτό που θέλουμε είναι τελικά να δούμε τι γονίδια εκφράζονται, τι γονίδια δεν εκφράζονται, να κάνουμε τέτοια ας πούμε φιλογενετικά δέντρα και να δούμε το προφίλ του ασθενή. Δεν έχει σημασία, απλώς θα το δείχνουμε περισσότερο σαν εικόνα να δείτε τι παίρνουμε. Και να το δούμε λίγο πιο συγκεκριμένα με ένα παράδειγμα που υπάρχει μέσα στο βιβλίο σας. Βλέπουμε για παράδειγμα ότι πήραμε ινοβλάστες, στους οποίους βάλαμε αυξητικούς παράγοντες και βλέπετε ότι προσθέσαμε αυξητικούς παράγοντες και μετά βλέπουμε το προφίλ της έκφρασης των ινοβλαστών κατά τη διάρκεια του χρόνου. Και όπως βλέπετε μπορείς κάνοντας μικροάρες, απομονώνοντας RNA μετά από 15 λεπτά από αυτά τα κύτρα, 30 λεπτά, 1 ώρα, 2 ώρες και μετά περνάντας από το μικροάρι βλέπετε χαρακτηριστικά ότι υπάρχουν κάποια γονίδια όπως όλα αυτά τα οποία αυξάνεται η έκφρασή τους μετά από κάποιες ώρες ενώ αντίστοιχα αυτά τα γονίδια έχουν να κάνουν κυταρικό κύκλο και πολλοπλασιασμό. Σκεφτείτε ότι αυτά βάλαμε αυξητικούς παράγοντες άρα λοιπόν είναι λογικό να υπερεκφράζονται γονίδια που έχουν να κάνουν κυταρικό κύκλο και πολλοπλασιασμό. Και επίσης παίρνουμε και άλλα γονίδια που έχουν να κάνουν μαγειογένες ή πίξτου έμπος τα οποία σταματά να εκφράζονται. Άρα λοιπόν σκεφτείτε ότι αυτά είναι κουκίδες διαφορετικές πάνω στο μικροάρι. Κάθισε και κάνεις τελικά έλεγχο ποιες κουκίδες γίνονται πράσινες, ποιες κουκίδες γίνονται κόκκινες, βλέπεις αυτή η κουκίδα σε ποια γονίδια τη στοιχή και μετά βλέπεις μπορώ να πάρω ένα συμπέρασμα σχετικά με αυτές τις κουκίδες, με αυτά τα γονίδια με τι έχουν να κάνουν, σε ποια βιοχημικά μονοπάτια συμμετέχουν. Το καταλαβαίνετε, ε? Άρα, για να το δούμε λίγο διαφορετικά, northern blot σας έχουν πει τι είναι. Ωραία, τι είναι το northern blot και πώς συσχετίζονται με τα μικροάρι. Ως ένα βαθμό, το northern blot δεν είναι ακριβώς το αντίστροφο αλλά θα μπορούσε να πεις ότι είναι το πιο πρωτόγονο αντίστροφο μικροάρι που θα μπορούσε να κάνεις. Στο northern blot τι θέλουμε να κάνουμε, βασικά θα και εκεί τι θέλουμε να κάνουμε, να δούμε την έκφραση ενός γονιδίου, όχι όλων των γονιδίων, ενός γονιδίου. Αλλά πώς γινότανε τα northern blots. Σκεφτείτε ότι στα northern blot απομονώνουμε το RNA από το κίτρο που μας ενδιαφέρει, το περνάμε από μια ηλεκτροφόρηση και το μονημοποιούμε και πάνω σε αυτή την ηλεκτροφόρηση πάμε και ελέγχουμε υβριδισμό, πάλι και υβριδισμό μιλάμε, συγκεκριμένο γονιδίου χρησιμοποιώντας ένα probe, έναν ανοιχνευτή. Πάρτε τώρα αλλιώς, στα microarrays παίρνουμε πολλούς ανοιχνευτές, τους στερεώνουμε και πάνω σε αυτό υβριδίζουμε το RNA από το κίτρο που μας ενδιαφέρει. Δεν είναι το αντίστροφο. Εδώ πέρα απομονώνουμε το RNA από το κίτρο που μας ενδιαφέρει, το στερεώνουμε και εκεί πάμε να ανοιχνεύσουμε ένα συγκεκριμένο γονίδιο. Στα microarrays παίρνουμε να ανοιχνεύσουμε όλα τα γονίδια τα οποία τα στερεώνουμε και πάνω εκεί υβριδίζουμε το RNA από τα κίτρα που μας ενδιαφέρουν. Είναι αντίστροφο. Ας το δούμε λόγω και σε πίνακα. Northern και συστηχεία. Στη μια περίπτωση αυτό που έχουμε είναι ο στόχος μας είναι μόρια cDNA επιστημασμένα με θεούλες χρωστικές ενώ στην άλλη περίπτωση είναι το μείγμα του RNA διαχωρισμένο. Και εδώ πέρα εδώ θέλουμε να ανοιχνεύσουμε στη συστηχεία δεκάδες χιλιάδες μόρια τα οποία είναι ήδη στερεωμένα ενώ εδώ πέρα αυτό που θέλουμε είναι να υβριδίσουμε το cDNA από τα κίτρα τα οποία μας ενδιαφέρουν. Η βασική διαφορά ποια είναι ότι σε μια περίπτωση έχουμε κάνουμε ένα γονίδιο σε κάθε έλεγχο ενώ εδώ πέρα μπορούμε να κάνουμε έλεγχο όλων μας τα γονίδια. Εντελώς διαφορετικές τάξεις μεγέθους γι' αυτό κιόλας μιλάμε ότι αυτές οι τεχνικές είναι οι πλατφόρμες αναλύσεων γονιδιωματικών αναλύσεων αυτό που είπαμε εξ αρχής. Ξεφεύγουμε εδώ και δέκα χρόνια από τη στιγμή που μπήκαμε στην γονιδιωματική επανάσταση ξεφεύγουμε από τον έλεγχο του ενός γονιδίου και πάμε πια σε έλεγχο συνολικά το τι γίνεται μέσα σε ένα κύτταρο. Λοιπόν, να δούμε λίγο και τις ολιγονοκλωτηδικές ιστοιχίες. Εδώ πέρα αυτό που κάνουμε είναι ότι χρησιμοποιούμε ακόμα μικρότερα κομματάκια τα οποία αντιστοιχούν όχι μόνο σε διαφορετικά γονίδια αλλά και σε διαφορετικές ισομορφές του ίδιου γονιδίου. Άρα λοιπόν μπαίνουμε ακόμα περισσότερο σε βάθος. Προφανώς οι ολιγονοκλωτηδικές ιστοιχίες βγήκαν ακόμα πιο μετά από τις μάικρος ιστοιχίες. Γιατί? Γιατί απλώς είχαμε πρόοδο της τεχνολογίας στερέωσης κομματιών DNA σε τσιπ. Άρα ενώ μετά πιο παλιά έπρεπε να στερεώσουμε μεγάλα κομμάτια σε τσιπ μετά είχαμε τη δυνατότητα να στερεώσουμε ακόμα πιο μικρότερα κομμάτια για να έχουμε πολύ περισσότερη βεστισία στους ελέγχους τους οποίους κάναμε. Έτσι λοιπόν εδώ πέρα μπορείς να ελέγξεις πολλά ολιγονοκλωτήδια τα οποία θα πάνε και θα συνδεχθούν σε διαφορετικές θέσεις και τι μπορούμε να ελέγξουμε. Όχι μόνο διαφορετικά γωνίδια και διαφορετικές εισομορφές γωνιδίων αλλά ακόμα και ακόμα και διαφορετικά αλληλόμορφα του ίδιου γωνιδίου. Γιατί μιλάμε για πολύ μικρή, για πολύ ψηλή ευεστησία, για αλλαγές ακόμα και σε ένα και σε δύο snp θα μας δώσουν διαφορετικά αποτελέσματα πότε μπορούμε να ελέγξουμε αυτά τα διαφορετικά αλληλόμορφα. Θα δείτε εδώ πέρα λοιπόν θα πάμε και θα στερεώσουμε πολλά διαφορετικά ολιγονοκλωτήδια και εδώ πέρα σε αυτά τα ολιγονοκλωτήδια πάλι με την ίδια λογική θα προσπαθήσουμε να εξετάσουμε το mRNA μας αν υβριδίζεται ή όχι. Βλέπετε ότι έχουμε λοιπόν δυνατότητα να ελέγξουμε πλήρως συμπληρωματικά νυχνευτές σε σχέση με άλλα που έχουν έσυτο κι ακόμα έναν ολιγονοκλωτήδιο όλο και όλο διαφορά και αντίστοιχα θα έχουμε ή δεν θα έχουμε υβριδισμό. Ο τρόπος τώρα αυτό που μας επιτρέπει με τις τεχνικές νεοπτικές ίνες είναι δυνατόν να έχουμε όσο και 50.000 διαφορετικά πηγάδια ανά ίνα οπότε μπορούμε να βάλουμε εντελώς περισσότερες μετρήσεις μπορούμε να κάνουμε ας πούμε σε ένα τέτοιο RNA ολιγονοκλωτηδικών συστηχειών μπορούμε να ελέγξουμε 50.000 πηγάδια. Αν έχουμε 96 ίνες μπορούμε να κάνουμε πέντε εκατομμύρια μετρήσεις. Άρα έχουμε πολύ μεγαλύτερη ευαισθησία. Εδώ βλέπετε ένα μηχάνημα αραί. Οι μικροσυστηχείες και όλοι οι συστηχείες DNA όπως είπαμε μπορούσαν να τα βάλεις σε ένα τέτοιο μικρό πραγματάκι. Υπάρχουν πολλές εταιρίες οι οποίες κάνουν και δίνουν τέτοια συνδυνατότητες. Αλλά οι πιο γνωστές είναι οι Αφιμέτρικς, οι Ατζιλέν, ταυτές ήταν οι δύο μεγαλύτερες εταιρίες που κάνανε αραις. Αλλά και η Λούμινα, γνωστή η Λούμινα και η Ρωσ προσφέρουν μηχανήματα για μικροάραις. Είναι ένας πολύ απλοϊκός κατάλογος. Βλέπετε ότι έχεις δυνατότητα πια να ελέγξεις σχεδόν οποιοδήποτε βασικό γωνιδίωμο το οποίο σε ενδιαφέρει, είτε άνθρωπο, είτε η κολλά, είτε δροσόφυλα, σκύλο, σι έλεγγανς, ράτ, σόιμπιν και τα λοιπά. Υπάρχουν αραιες τα οποία ακριβώς μπορείς να ελέγξεις την έκθεση των γωνιδίων. Και πόσο μπορεί να σου στοιχήσει κάτι τέτοιο. Σκεφτείτε ότι άμα έχεις το μηχάνημα, έχεις ένα μηχάνημα αραιή, τα τσίπ δεν χρειάζονται. Τώρα είναι απλοϊκό αυτό αλλά θα σας δείξω τι γίνεται. Το κάθε τσίπ για να κάνεις ένα υβρετισμό κοστίζει 100 δολάρια. Θέλεις καμιά 20 διαφορετικά τσίπς για να μπορέσεις να κάνεις πολλές επαναλήψεις. Άρα θέλεις 2.000 δολάρια συν 2.000 αναλώσιμα για να μπορέσεις να έχεις κάποια αποτελέσματα. Αυτό που χρειάζεσαι, σας το είπα λίγο πιο πριν, είναι ότι χρειάζεται και επαλήθευση των αποτελεσμάτων. Και πώς θα την κάνεις αυτήν την επαλήθευση. Σκεφτείτε ότι έχουμε σκανάρει τα 6.000 γωνίδια της ζύμης. Και έχουμε βρει ποια εκπαιρεκφράζονται και ποια υποεκφράζονται. Αυτό θέλεις με διάφορους αρτιστικές μεθόδους να έχεις σύν πλήν 10% αύξηση στην έκφραση. Δεκαπλάσια έκφραση. Δεν θα πάρεις λαδιτυχία κάποια γωνίδια, αλλά θα πάρεις αυτά που είναι στα άκρα της έκφρασης. Αυτά που έχουν υπερεκφραστεί και αυτά που έχουν υποεκφραστεί. Εκεί πέρα λοιπόν έχεις ταυτοποιήσει κάποια γωνίδια που λες ότι τα μάικρο άρις μου λένε ότι αυτά τα γωνίδια είναι αυτά τα οποία θέλω να ελέγξω. Και πώς θα πας μετά εκεί πέρα. Εκεί μετά θέλει το κάθε γωνίδιο ξεχωριστά να το ελέγξεις. Θα πρέπει να κάνεις quantitative PCR, δηλαδή real time PCR να κάνεις, να πάρεις ποια να εστιαστείς στο καθένα από αυτά τα γωνίδια ξεχωριστά. Και να πεις θέλω αυτό το γωνίδιο της ολινίνης να το κάνω πια και έλεγχο ξεχωριστά το καθένα γωνίδιο για να μπορώ να πω ότι όντως εκφράζεται και με έναν άλλο τρόπο. Να υπαληθεύσω τα αποτελέσματα του μάικρο άρι. Τώρα αυτά μπορεί να είναι λίγο απλοϊκά, αλλά μπορείς τελικά να βγάλεις κάποιες καλές εργασίες και υπάρχουν πάρα πολλές εργασίες με μάικρο άρι. Άμα θέλετε να ασχοληθείτε με μάικρο άρι, δόξα στον Θεό εδώ πέρα διάφορες πληροφορίες. Και αυτά με τα μάικρο άρι. Λοιπόν, τελειώσαμε με τα μάικρο άρι. Το άλλο, το τρίτο μηχάνημα το οποίο μας ενδιαφένει ο φασματογράφος Μάζας. Mass spectrometer. Αυτό τι δυνατότητα έχει. Είναι ένα μηχάνημα το οποίο μας δίνει τη δυνατότητα να υπολογίσει τη μάζα των μωρίων, τα οποία κινούνται μέσα σε ένα ηλεκτρικό πεδί με βάση ταχύτητα μετακίνησης τους. Έτσι λοιπόν χρειαζόμαστε ένα μηχάνημα ιωνιστή για να προκαλεί ιωνισμό στα μώρια τα οποία μας ενδιαφέρουν. Ένα αναλυτή ο οποίος θα μας ελέγξει την ταχύτητα που θα τρέξει αυτό το μώριο μέσα από το ηλεκτρικό πεδίο και ο νυχνευτής ο οποίος θα μας δώσει το αποτέλεσμα. Έτσι, η πηγή ιωνισμού ιωνίζει, ο αναλυτής μας διαχωρίζει τα τμήματα ανάλογα με το πηλί κομμάζα και φορτία και ο νυχνευτής μας υπολογίζει το χρόνο του ιωνισμού. Γιατί μας ενδιαφέρουν όλα αυτά. Γιατί όταν περάσουμε διαφορετικά μώρια με ένα φασματογράφο μαζών θα πάρουμε διαφορετικές τιμές και εκεί πέρα συγκρίνεις αυτές τις τιμές με βάση δεδομένων. Και δεν μας ενδιαφέρει τόσο μόνο για μώρια DNA αλλά είναι πολύ σημαντικά αυτά τα μηχανήματα και για πρωτεΐνες. Για να ταυτοποιείς πρωτεΐνες είναι το πιο σημαντικό μηχάνημα που έχουμε ώστε να μπορέσουμε να καταλάβουμε τι πρωτεΐνες υπάρχουν μέσα σε ένα κύτταρο. Ασχοληθήκαμε με τα μηχανήματα αλληλούχησης τα οποία μας δουλεύουν κυρίως σε επίπεδο DNA. Με τα μάικρο αρέης τα οποία μας δουλεύουν σε επίπεδο RNA. Και οι φασματογράφοι μαζών μας δουλεύουν περισσότερο σε επίπεδο πρωτεΐνών. Άρα είναι τα τρία διαφορετικά μηχανήματα τα οποία τα δουλεύουμε σε τρία διαφορετικά επίπεδα. DNA, RNA και πρωτεΐνες. Βέβαια ο φασματογράφος μαζών δεν μας δίνει μόνο αποτέλεσμα σε πρωτεΐνες. Να δούμε λίγο τι άλλο έχουμε. Ένα βασικό πράγμα που μπορεί να μας κάνει επίσης είναι να μας αλληλουχήσει πεπτίδια. Δηλαδή να έχεις μια συνολική πρωτεΐνη. Η πρωτεΐνη αυτή να σπάσει σε μικρότερα πρεπτίδια. Τα πρεπτίδια αυτά θα τα ξαναπεράσουμε μέσα από τον φασματογράφο μαζών από ένα μηχάνομα που λέγεται tandem mass spectrometer. Συγκεκριμένα μπορείς να το πεις MS-MS. Ένας σειριακός φασματογράφος μαζών. Οπότε να υπολογίσουμε και τελικά να αλληλουχήσουμε τις πρωτεΐνες. Και πέρα από αυτό μπορείς να κάνεις ακόμα και γεννητήψεις SNIPS. Δείτε λίγο εδώ πέρα έστω ότι έχεις μια ηλεκτροφόρηση πρωτεΐνών. Παίρνεις αυτό το σημείο, παίρνεις την πρωτεΐνη σου, της πάρεις σε πρεπτίδια και παίρνεις το κάθε ένα πρεπτίδιο να το περάσεις από εδώ πέρα. Αφού το περάσεις από εδώ πέρα, παίρνεις μια κορυφή που αντιστοιχεί σε κάποιοι από αυτά τα πρεπτίδια και μετά τα πρεπτίδια τα ξανασπάσεις σε μικρότερα. Οπότε περνάει από το MS-MS, παίρνεις διαφορετικές κορυφές που αντιστοιχούν στον κάθε αμυνοξή ξεχωριστά. Και έτσι λοιπόν με πολύ πλοκαβιοπληροφορικά μοντέλα μπορείς να συνειδητοποιήσεις ποια είναι αυτά τα αμυνοξεία που αποτελούν αυτά τα πρεπτίδια και αντίστοιχα πιάνει τα αμυνοξεία που αντιστοιχούν σε όλα αυτά τα πρεπτίδια και να πας να βρεις και πρωτεΐνη είναι. Άρα κάνεις πας από το αμυνοξή στο πρεπτίδιο στην πρωτεΐνη και αλληλουχείς ολόκληρη την πρωτεΐνη. Και το άλλο το οποίο μπορείς να κάνεις είναι με το φασιματογράφο μαζόν όχι μόνο να αυτοποιήσεις πρωτεΐνες, αλλά να γενοτυπήσεις και SNPs. Σκεφτείτε ότι έχεις ένα SNP σε μια συγκεκριμένη αλληλουχία DNA. Αν δεν είναι στη μια περίπτωση, θυμίνεις στην άλλη περίπτωση. Αν πας και κάνεις PCR αριστερά και δεξιά σε ένα μικρό κομμάτι που περιλαμβάνει αυτό το SNP, παίρνεις δύο διαφορετικά PCR προϊόντα που, άμα τα περάσεις σε αυτά τα PCR προϊόντα από ένα μηχάνημα IMEs, άλλη ταχύτητα θα έχει το ένα και άλλη ταχύτητα θα έχει το άλλο. Άρα λοιπόν όπως θα το περάσεις από το IMEs μπορείς να πάρεις μια κορυφή που θα αντιστοιχεί, θυμίνει, θυμίνει εδώ πέρα, μια άλλη κορυφή που θα αντιστοιχεί, και τόσο είναι και τόσο είναι αυτό το SNP μας που θα είναι εδώ πέρα. Ή παίρνεις δύο κορυφές οι οποίες είναι το ετεροζηγότης, ο άνθρωπος ο οποίος είναι το ετεροζηγότης. Άρα με αυτό το μηχάνο μπορείς και να γενοτυπήσεις και SNPs, πέρα από τις πρωτέινες. Και εδώ χρησιμοποιούνται κάποιες φορές. Έτσι και λοιπόν έχουμε πει ότι για τα SNPs υπάρχουν πάρα πολλές προσεγγίσεις, επιστημονικές διαδικασίες με τις οποίες μπορείς να κάνεις SNPs, γενοτύπηση. Εντάξει, αυτά. Με το καινούργιο έτος έχουμε να συζητήσουμε λίγο με εφαρμογές. Είπαμε τα τρία τα διαφορετικά τα μηχανή με τη λειτουργική γονιδιωματική. Άρα λοιπόν στα τελευταία μαθήματα που μας μένουν με το καινούργιο έτος είναι ακριβώς να συζητήσουμε τις εφαρμογές αυτών των μηχανημάτων σε λειτουργική γονιδιωματική πιά και να δούμε τι μπορούμε να καταφέρουμε. Εντάξει, καλές γιορτές.