Δομική γονιδιωματική (5) / Διάλεξη 8 / Στόχοι Μελέτης, DNA – Ο φορέας της γενετικής πληροφορίας, Προβλήματα στην αλληλούχιση και μέθοδοι αντιμετώπισης τους, Χρωμοσωμικοί, Γενετικοί, Φυσικοί χάρτες και Χάρτες αλληλουχίας (και Ασκήσεις), Νέα μηχανήματα αλληλούχισης, Συναρμολόγηση και αποθήκευση δεδομένων, To μέλλον των αναλύσεων, Εύρεση γονιδίων στις αλληλουχίες γονιδιωμάτων - Τριανταφυλλίδης Αλέξανδρος (ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ, 2014)
Στόχοι Μελέτης, DNA – Ο φορέας της γενετικής πληροφορίας, Προβλήματα στην αλληλούχιση και μέθοδοι αντιμετώπισης τους, Χρωμοσωμικοί, Γενετικοί, Φυσικοί χάρτες και Χάρτες αλληλουχίας (και Ασκήσεις), Νέα μηχανήματα αλληλούχισης, Συναρμολόγηση και αποθήκευση δεδομένων, To μέλλον των αναλύσεων, Εύρεση γονιδίων στις αλληλουχίες γονιδιωμάτων: Αυτό είναι ο σκοπός μας. Οπότε μετά, θα κάνουμε και κάποιες ασκησούλες με φυσικούς χάρτες. Άρα λοιπόν σήμερα ασχολούμαστε, τελειώνουμε θεωρία και κάνουμε και ασκήσεις. Αυτός είναι ο σκοπός μας. Οπότε μετά, θα κάνουμε και κάποιες ασκήσεις με φυσικούς χάρτες. Άρα λοιπόν σήμερα ασχολούμαστε, τελειώνουμε θεωρία και κάνουμε και ασκήσεις. Αυτός είναι ο σκοπός μας. Οπότε μετά, θα έχουμε μιλήσει για γενετικούς χάρτες, για φυσικούς χάρτες και πια θα πούμε σε αυτή κατά αυτή την αλληλούχηση. Ποιος θέλει να πει, ποιοι είναι οι τρόποι με τους οποίους μπορούσαμε να κάνουμε φυσικούς χάρτες. Από τη στιγμή που έχουμε γενετικούς χάρτες, να θυμηθούμε με τι τρόπους μπορούμε πια να αρχίσουμε να φτιάχνουμε φυσικούς χάρτες. Μας μένει ένας τελευταίος τρόπος, τον οποίο θα πούμε σε λίγο, αλλά ας κάνουμε λίγο μια περιλήψη του χθεσινού. Είναι η πιο ακριβής τρόπος με τους οποίους μπορούμε να το κάνουμε. Είναι με βάση την πληροφορία που έχουμε τους γενετικούς χάρτες, να χρησιμοποιήσουμε τους γενετικούς δίκτυους που ξέρουμε ότι είναι στενά συνδεδεμένοι και να προσπαθήσουμε να συνδέσουμε τους κλόνους στους οποίους βρίσκουμε αυτούς τους γενετικούς δίκτυους συνδεδεμένους. Αλλά όπως είπαμε αυτό ήταν αρκετά δύσκολο ή τουλάχιστον επίπονο και πάρα πολύ χρονοβόρο και πάρα πολύ ακριβό σε κόστος. Οπότε μετά ξεκινήσαμε σιγά σιγά να κάνουμε συνεχείς πέψεις και να βλέπουμε στους κλόνους την αλπικάληση με βάση τα κοινά κομμάτια. Αυτά είναι οι δύο τεχνικές από κάτω προς τα πόνια. Πιστεύουμε ότι υπάρχει και μια τεχνική από πάνω προς τα κάτω. Από τι χρησιμοποιούμε και ποια τεχνική χρησιμοποιούμε? Τη φύση. Λοιπόν, μας μένει ένας τρίτος τρόπος με τον οποίο μπορούμε να δουλέψουμε, που κι αυτός χρησιμοποιήθηκε από κάποια στιγμή και μετά, κι αυτόν θα συζητήσουμε αυτή τη στιγμή, είναι με τη βοήθεια αλληλουχικών θέσεων σημεών. Sequence Tag Site είναι. Sequence Tag Site. Site είναι η θέση. Sequence είναι η αλληλουχία και το Tag είναι η σημαία. Πώς λέμε κάνουμε Tag στο Facebook ότι είμαι εδώ πάντων, αυτό. Άρα βάζει μια σημαία ότι κάπου είσαι αυτή τη στιγμή. Έτσι, λοιπόν, τι είναι αυτές οι αλληλουχικές θέσεις σημαίες πρώτα απ' όλα. Καθώς οι ερευνητές αρχίσαν να παίρνουν όλο και περισσότερες πληροφορίες γενετικούς δείκτες, γιατί φτιάξανε το κόσμο τους μικροδροφορικούς τόπους, τους οποίους τους βάλουν σε μια σειρά. Άρα είχαν χιλιάδες μικροδροφορικούς τόπους, τους οποίους τους ξέρανε. Είχαν επίσης και άλλες πληροφορίες σχετικά με snips που όλο και περισσότερο βρίσκαν πολυμορφισμούς, που επίσης ξέραν τις συγκεκριμένες τους θέσεις. Άρα, λοιπόν, αρχίσανε και βάζανε πάνω στο γωνιδίωμα, σε συγκεκριμένες θέσεις, σημαίες ότι εδώ έχω αυτόν τον τόπο, εκεί έχω τον άλλο τόπο, παρακάτω έχω τον άλλο τόπο. Και ξέρανε, λοιπόν, αυτές τις θέσεις. Γνωρίζοντας αυτές τις θέσεις, μπορούσανε πια να ξεκινήσουνε να χρησιμοποιούν αυτή την πληροφορία, όχι πια με βάση το άμα αυτή η τόπη είναι στενά συνεδεμένη ή όχι, απλώς με την ύπαρξη αυτών των τόπων. Και εφόσον αυτούς τους τόπους κάνανε υβρυδισμούς και τους βρίσκανε στον ίδιο κλόνο, τι σήμανε κατευθείαν ότι αυτή η τόπη είναι κοντά, στενά ο ένας με τον άλλο. Δηλαδή, κατά κάποιο τρόπο, ενώ ξεκινήσανε να κάνουν γενετικούς χάρτες για να κάνουν φυσικούς χάρτες, βρήκανε του κόσμου τους γενετικούς δίκτες, τους οποίους αρχίσανε να τους χρησιμοποιούν αυτούς καθ' αυτούς μέσα στους φυσικούς χάρτες. Τι σημαίνει αυτό, τι χρειαζόταν σε αυτές τις περιπτώσεις. Βλέπετε, για παράδειγμα, εδώ πέρα, ότι έχουμε τα διάφορα bugs, που είναι διαφορετική κλόνη, και έχουμε διαφορετικούς τόπους. Αυτοί οι τόποι υπάρχουν, και εφόσον είναι κοντά ο ένα και ο δύο, ο τόπος, τότε μπορεί να μην το ξέρεις αυτό το πράγμα, πλώς θα το κάνεις στην τύχη. Τι χρειάζεται να κάνεις, άμα ξέρεις αυτούς τους τόπους, ξέρεις και τις περιοχές αριστερά και δεξιά. Άμα ξέρεις τις περιοχές αριστερά και δεξιά, που είναι μοναδικές, τότε μπορείς να κάνεις PCR. Μπορείς να κάνεις PCR με τους εικηνιτές γι' αυτό το τόπο και να ελέγξεις όλα σου τα bugs, PCR σε 15.000 bugs, δηλαδή, για να δεις πού κολλάνε. Όπως καταλαβαίνετε, λοιπόν, αυτός ο τόπος, άμα κάνεις PCR σε 15.000 bugs, υποθετικά θα πάρεις αποτέλεσμα μόνο στο bug 1, bug 2, bug 3, bug 4. Αυτό θα έχεις πάρει σε 15.000 PCR, θα πάρεις τέσσερα μόνο θετικά αποτελέσματα σε αυτά τα τέσσερα bugs. Δεν το ξέρεις αυτό, αλλά απλώς θα σου το δείχνω πώς είναι για να καταλάβεις τελικά ποιο είναι τα αποτελέσματα. Όταν πάρεις λοιπόν αποτελέσματα που θα έχεις τέσσερα θετικά αποτελέσματα σε αυτά τα τέσσερα bugs, τι καταλαβαίνεις? Ότι εφόσον και τα τέσσερα ενισχύουν αυτόν τον τόπο, τι σημαίνει όσον αφορά αυτά τα τέσσερα bugs ότι είναι αλπικαλυπτόμενο. Με την ίδια λογική, άμα κάνεις και PCR για τον STS2, sequence tag site 2, τότε θα πάρεις θετικά αποτελέσματα για τα 2, 3, 4 και 5 bugs. Αμέσως αμέσως καταλαβαίνεις ότι το bug 1 είναι λίγο πιο αριστερά, ή λίγο πιο δεξιά, δεν το ξέρεις ακόμα, σε σχέση με τα άλλα τρία bugs. Και με αυτόν τον τρόπο αρχίζεις και βάζεις τους clones σε σειρά. Άμα το δούμε και εδώ πέρα, από μια εικόνα μέσα από το βιβλίο σας, βλέπετε ότι έχουμε αυτά τα τέσσερα STS, δεν ξέρεις ακόμα τις σχετικοί τους θέσεις, απλώς αποφασίζεις να κάνεις PCR. Έχεις τους εγκινητές για αυτό το STS2, για παράδειγμα, ή για αυτό, ή για αυτό, ή για αυτό. Εσύ κάνεις PCR ή υβριδισμό σε όλα τα bugs που έχεις στη βιβλιοθήκη και παίρνεις διάφορα αποτελέσματα που καταλαβαίνεις ότι αυτό τον bug ενίσχυσε μόνο τον 1, αυτό τον bug ενίσχυσε τον 1 και τον 2, αυτό τον bug ενίσχυσε τον 1, τον 2 και τον 3. Και μετά αρχίζεις να τα βάζεις σε μια σειρά και τι κάνεις τελικά, οι ελπικαλυπτόμενοι κλόνις σου συναρμολογούνται σε έναν άλλο κόντικ. Αυτή είναι η λογική. Με αυτή τη λογική μπορέσανε και βρήκανε να συναρμολογήσουνε κλόνους YAK, για να μπορέσουνε, ας πούμε, στο χρωμόσομα 7 του ανθρώπου να ενώσουνε τα δύο διαφορετικούς κλόνους για να μπορέσουνε τελικά να κατασκευάσουνε κόντικ που αντιστοιχούσανε στο χρωμόσομα 7. Βλέπετε, για παράδειγμα, ότι στον κλόνο YAK 415, αντιστοιχή με υβριδισμό ή με PCR όταν κάνανε, θα πήραν αποτέλεσμα για το μικροδροηφορικό τόπο 268, για το μικροδροηφορικό τόπο 1441, για το μικροδροηφορικό τόπο 207, 984 και 825. Αυτοί οι πέντε οι τόποι, κολλούσανε και παίρναν αποτέλεσμα σε αυτό το YAK και σε πεις και σε κάποια άλλα. Με αυτή τη λογική μπορέσανε να φτιάξουνε και να συνδέσουνε τους διαφορετικούς κλόνους. Και εδώ σας έχω μια ερώτηση σε σχέση με αυτή την εικόνα, για να δούμε αν την καταλαβαίνετε. Ποιος είναι ο ελάχιστος αριθμός YAK που χρειάζονται για να έχουμε ολόκληρο το χρωμόσομα 7 και ποια είναι τα YAK αυτά. Δηλαδή, προσπαθήστε να βρείτε τον ελάχιστο διαδρομή, ώστε να ξεκινήσετε από τη μία άκρη του χρωμόσοματος 7 μέχρι την άλλη άκρη του χρωμόσοματος 7, με τα ελάχιστα δυνατά YAK που μπορείτε να χρησιμοποιήσετε. Το καταλαβαίνετε αυτό που ρωτάω, ε? Για δείτε το λίγο και θα το βρούμε. Ποιοι δεν το βρήκανε. Να το δούμε μαζί. Ποιος θα ραλέω στέλνει να πει ότι δεν το βρήκε. Να το δούμε λίγο μαζί. Πες, πού μπερδεύεσαι. Δεν καταλαβαίνεις μόνο την εικόνα πώς είναι. Αυτό είναι το προβληματισμό σου. Αυτό που έχουμε πει τι είναι, είναι ότι έχουμε τους κλόνους μου, αρχικά ξεκινήσαμε από το χρωμόσομα 7, το σπάσαμε σε κομματάκια, τα οποία τενσωματώσαμε σε κλόνους YAK. Άρα λοιπόν, όλα αυτά είναι κομματάκια που αντιστοιχούν όλους στον χρωμόσομα 7. Είναι διαφορετικά τμήματά του. Άλλα ήταν πιο μεγάλα, άλλα ήταν πιο μικρά. Αυτά τα τμήματα λοιπόν, αρχικά τα είχαμε και ίσως ας πούμε όλους αυτούς τους κλόνους με φυς, που κάναμε στην αρχή, ξέραμε ότι όλοι αυτοί όταν κάναμε υβρεδισμό αυτόν τον κλόνου στον χρωμόσομα 7, πηγαίνουν και κολλούσανε κάπου στον χρωμόσομα 7. Άρα ξέραμε εξ αρχής ότι όλοι αυτοί οι κλόνοι αντιστοιχούν στον χρωμόσομα 7. Γιατί σκεφτείτε ότι όταν κάνουμε τη δουλειά, κάνουμε από μόνο στην DNA που έχουμε όλα τα χρωμοστώματα μαζί. Δεν μπορούμε να ξεχωρίσουμε πρώτα απ' όλα να δουλέψουμε τώρα με το χρωμόσομα 7. Έχουμε όλους τους κλόνους μαζί. Αν έχουμε όλους τους κλόνους μαζί, αρχικά τους διαχωρίζουμε αναχρωμόσομα. Και αφού τους διαχωρίζουμε αναχρωμόσομα, μπορούμε να αρχίσουμε να κάνουμε υβρυδισμό ή PCR το κάθε μικροδροηφορικό τόπο σε αυτούς τους κλόνους. Με τους υβρυδισμούς, ας πούμε, βρήκαμε ότι αυτός, αυτός, αυτός, μέχρι εδώ πέρα αυτή η μικροδροηφορική τόπη υβρυδίζονταν ή ήταν θετικό PCR σε αυτόν τον κλόνο. Εντάξει. Άρα, λοιπόν, με αυτόν τον τρόπο αρχίζουμε και κάνουμε επικαλείψεις. Και βλέπουμε, για παράδειγμα, αυτός ο κλόνος και αυτός ο κλόνος επικαλείπτονται σε αυτή την περιοχή. Αυτός ο κλόνος και αυτός ο κλόνος επικαλείπτονται σε αυτό εδώ πέρα την περιοχή. Σκεφτείτε και θέλω να το καταλάβετε αυτό το πράγμα, ότι αυτό είναι όλο και όλο μια θέση. Εκεί παιδεύεστε και παιδεύεστε πάρα πάρα πολλές φορές. Άλλο ο κλόνος που είναι ένα τεράστιο κομμάτι χρωμοσομικού DNA και άλλο ο μικροτερροφορικός οτόπος, το Sequence Tag Site, το STS, το οποίο είναι μια θέση 500 βάσεις. Για δηλαδή, στην πραγματικότητα, αυτός ο κύβος είναι πολύ υπερβολικά μεγάλη κλίμακα που το έχουμε κάνει. Τελικά, θα έπρεπε να είναι μια κουκίδα όλο και όλο επάνω σε αυτόν τον κλόνο, που ούτε καν θα φαινόταν. Απλώς το κάνουμε για λόγους εικόνας. Και έτσι, λοιπόν, με αυτή τη λογική βρίσκεις επικαλύψεις. Αυτό επικαλείπτε με αυτό, αυτό με αυτό. Αυτά τα τρία, βλέπετε, είναι μικρά κομματάκια που όλα επικαλείπτονται, που δεν τα χρειαζόμαστε, αν θέλουμε να δούμε την ελάχιστη διαδρομή για να μπορέσουμε να πάμε από τη μια άκρη στην άλλη. Ψιλοκατάλαβες, λέω, καλύτερα την εικόνα. Με αυτή τη λογική θέλουμε να ξεκινήσουμε από τη μια άκρη και πηγαίνοντας κάπως έτσι, δεν ξέρω, τελικά να φτώσουμε στην άλλη άκρη. Και πώς το κάνουμε αυτό, πώς είναι αυτή η ελάχιστη κλόνη που χρειαζόμαστε. Ναι. Δημήτρης, ναι. Τέσσερις. Ποιοι μπορεί να είναι, πες εσύ αυτός τους τέσσερις. Ναι. 1139. Ξεκινάμε, λοιπόν, από εδώ πέρα, από τη μια άκρη φτάνουμε μέχρι εδώ. Το 32.09 κατεβαίνουμε εδώ κάτω, προχωράμε μέχρι εδώ πέρα. 3983 φτάνουμε από εδώ μέχρι εδώ. Δύο έχουμε επιλογές, όχι τρεις. Ή αυτό, ή αυτό. Αυτό εδώ πέρα δεν είναι γιατί δεν υπάρχει επικάλυψη. Άρα, λοιπόν, ο τέταρτος κλόνος που μπορούμε να επιλέξουμε μπορεί να είναι ή ο 4139 ή ο 1149. Εντάξει. Και έτσι, λοιπόν, έχουμε την επικάλυψη των κλόνων μας, με την οποία θα δουλέψουμε για να μπορέσουμε να έχουμε τέτοιον αλληλούχιση. Με αυτόν τον τρόπο έχουμε σπάσει το χρωμό σαν αυτό σε μικρότερα κομμάτια, το οποίο θα δούμε στα επόμενα μαθήματα ότι, βεβαίως, τι θα χρειαστεί να κάνουμε. Να το σπάσουμε σε ακόμα μικρότερα κομμάτια για να κάνουμε αλληλούχιση, γιατί αυτά τα κομμάτια είναι εκατοντάδες χιλιάδες βάσεις. Και είπαμε ότι τα μηχανήματα που είχαμε, στην καλύτερη των περιπτώσεων, διαβάζαν 600 βάσεις όλο και όλο. Ερώτηση ο Άλντο. Μια αλήθεια είναι ότι ήθελα να τσεκάρω ποια είναι η διαφορά του πορτοκαλί από τον μπλε και ξέχασα να το κάνω, οπότε θα πρέπει να κοιτάξουμε λίγο το βιβλίο σας, γιατί αυτό κίτρινο και το άλλο είναι μπλε. Θα το δούμε μετά, θα σας το πω αύριο. Ήθελα να το κάνω και το ξέχασα. Τα SDS είναι τα από πάνω, το SW σημαίνει μικροδροφορικός τόπος. Είναι διαφορετικές θέσεις, θέσεις μικρές επάνω στα χρωμοσώματα, που έχουν χαρακτηριστική θέση, είναι tagged δηλαδή, επάνω στις συγκεκριμένες περιοχές των χρωμόσωμων. Αφού το καταλάβατε αυτό, να κάνουμε λίγο μια σκησούλα, δύο σκησούλες πώς είναι τέλος πάντων. Λοιπόν, τι έχουμε εδώ πέρα, εδώ πριν ξεκινήσετε, ορολογία, μιλήσαμε για SDS, έχουμε και τα ESD. Τα ESD, τα ξέρετε, θα τα μάθετε, γιατί θα τα ακούσετε από μένα, θα τα ακούσετε από την κυρία Δροσοπούλου και γενικά είναι μια ένας πολύ γνωστή, θα τα ακούσετε από την κυρία Ντάφω, από την κυρία Χατζοπούλου. Είναι πολύ γνωστός όρος στη Μοριακή Βιολογία. ESD σημαίνει expressed sequence tag, δηλαδή είναι μια περιοχή χαρακτηριστική μιας αλληλουχίας, η οποία είναι expressed, που είναι εκφραζόμενη. Άρα τι καταλαβαίνετε ότι είναι αυτό, εφόσον είναι εκφραζόμενη, είναι μικροδροηφορικός τόπος ας πούμε, μάλλον όχι. Τι είναι, γονίδιο. Είναι κομμάτι γονιδίου συγκεκριμένα, γιατί τα ESD πώς προκύψανε. Τα ESD είναι όταν οι ερευνητές κάνανε cDNA βιβλιοθήκες, που σημαίνει ότι απομονώνουν το mRNA από τα κύταρα και μετά το βάζανε σε βιβλιοθήκες και μετά κάνανε αλληλούχη σε αυτές βιβλιοθήκες, τι σημαίνει αυτό. Ότι προφανώς αλληλουχούσανε κομμάτια γονιδίων, σωστά. Γιατί αν έχεις πάρει το mRNA από τα κύταρά σου, αυτό το mRNA έχει προκύψει από την έκφραση των γονιδίων. Με κάποιες εξαιρέσεις θα τις δούμε στο μέλλον. Άρα λοιπόν έπαιρναν κομμάτια γονιδίων, τα αλληλουχούσανε και αυτές οι αλληλουχίες ήταν αυτές οι οποίες μας ενδιαίφεραν. Και ήτανε κομμάτια γονιδίων γιατί. Γιατί εφόσον έχουμε αλληλούχηση κομματιού mRNA μέσα σε μια βιβλιοθήκη, πάλι όπως είπαμε τα μηχανήματά μας, μπορούσαν να μας δώσουν μεγέθη περίπου 600 βάσεις. Και είναι ένα πολύ μικρό τύμα από ένα γονίδιο. Γι' αυτό λέμε ότι τα ESTs είναι κομμάτια γονιδίων. Είναι συγκεκριμένες θέσεις, συγκεκριμένες αλληλουχίες που έχουνε προκύψει από την αλληλούχηση στην DNA βιβλιοθήκης. Και αντιστοιχούν μάλλον σε κομμάτια γονιδίων. Καμιά φορά μπερδεύεται το EST με το STS. Ερώτηση. Ένα EST είναι πάντα STS ή ένα STS είναι πάντα EST. Ποιο είναι το σωστό. Έχω δύο φράσεις. Ένα EST είναι πάντα STS. Η άλλη φράση είναι ένα STS είναι πάντα EST. Είναι σωστό το ένα, το δύο, και τα δύο. Κανένα. Δεν ξέρω δεν απαντώ. Κοιμάμαι ακόμα. Τι. Τα τελευταία. Για σκεφτείτε το. Πες άλλο. Το πρώτο τι. Είναι πάντα STS. Το δεύτερο είναι σωστό ή όχι. Συνήθως το δεύτερο μπορεί και να μην είναι σωστό γιατί STS μπορεί να είναι και μικροδροφωρικός τόπος. Μπορεί και να είναι ένα SNP. Ένα SNP είναι μια θέση όλο και όλο. Δεν είναι η ST αυτό το πράμα. Το καταλαβαίνετε. Το EST είναι κομμάτιγον ιδίου. Προφανώς είναι μοναδική περιοχή. Άρα είναι χαρακτηριστική θέση σημαία. Άρα είναι STS. Ενώ το STS μπορεί να είναι μικροδροφωρικός τόπος η SNP. Άρα μπορεί να μην είναι η ST. Μπορεί οτιδήποτε άλλο ας πούμε. OK. Αυτό λίγο εισαγωγικά. Ό,τι θέλετε. Ναι, πες. Πιο δυνατά. Δεν σε ακούω άλλο. Εφόσον το έχω πάρει το mRNA, κανονικά υποτίθεται ότι δεν έχετε ρυθμιστικές περιοχές μέσα στο mRNA σου. Οι ρυθμιστικές περιοχές είναι πριν την περιοχή που εκφράζει. Εκτός αν μιλάμε για τις περιοχές οι οποίες κατευθύνουν το mRNA για το που θα πάει. Πώς το εννοείς ρυθμιστική περιοχή? Δεν σε ακούω. Συνήθως δεν τις έχεις αυτές μέσα στο EST. Τις ρυθμιστικές αυτές περιοχές. Λοιπόν, έχουμε εδώ πέρα λοιπόν, τι μας λέει αυτή η άσκηση, ότι έχουμε έναν χάρτη-κόντικ του χρωμοσώματος 3. Δηλαδή, σπάσαμε το χρωμόσωμα 3 του αραβιδόψης σε διάφορα κομμάτια κλώνον, όλοι αυτοί είναι κλόνισσου, οι οποίοι έχουν μπήκει σε μια σειρά. Άρα λοιπόν, αυτά συμπληρώνονται, ελλειπικαλύπτονται για να μας δώσουν το χρωμόσωμα 3. Υποθετικά λοιπόν έχουμε συναρμολογίσει τα διαφορετικά τα κομμάτια. Θέλεις να πάρεις ένα σκαμπό από εκεί πέρα, ε? Και τώρα, τα βλέπουμε λοιπόν πώς είναι. Το A ελλειπικαλύπτεται με το Β, το Σ με το Α δεν ελλειπικαλύπτεται, φαίνεται αυτό το πράγμα, εντάξει. Το Β με το Σ επικαλύπτεται, το Σ, Δ και Ή επικαλύπτεται, το Ι με το Φ επικαλύπτεται και το καθεξής. Και σας λέει λοιπόν, ένα ΙΕΣΤ έστω το ότι υβριδίζεται με τους γωνιδιωματικούς κλόνους Σ, Δ και Ή, αλλά όχι με άλλους κλόνους. Σε ποιο τμήμα του χρωμόσωματος 3 βρίσκεται αυτό το ΙΕΣΤ. Βλέπετε ότι έχουμε σπάσει το χρωμόσωμά μας για λόγους οπτικούς σε διαφορετικά τμήματα. Σε ποιο τμήμα βρίσκεται αυτό το ΙΕΣΤ. Ναι, Ηρακλή. Στο πέντε. Γιατί το πέντε, όντως το πέντε, γιατί βλέπετε ότι είναι αυτό το κομμάτι που επικαλύπτεται και τα τρία τα κομμάτια. Ποιο κλόνι δεν θα μπορούσε να είναι το τέσσερα γιατί στο τέσσερα δεν έχουμε κομμάτι από τον κλόνο ε. Και τι θυμόμαστε ότι το ΙΕΣΤ είναι ένα μικρό μικρό κομματάκι, είναι πεντακόσες βάσεις. Δεν είναι δυνατόν να πιάνει τόσο μεγάλη περιοχή για να μπορεί να πιάνει και στην περιοχή τέσσερα. Αυτό σημαίνει ότι θα έχουμε μια περιοχή που ξεκινάει από εδώ και φτάνει μέχρι εδώ πέρα, το οποίο δεν γίνεται, γιατί το ΙΕΣΤ είναι μια κουκίδα επάνω εδώ πέρα, άρα αυτή η κουκίδα αναγκαστικά πρέπει να βρίσκεται στο τμήμα πέντε. Εντάξει. Μετά, έστω ότι ο κλόνος ενός γωνιδίου, δηλαδή πάλι ένα μικρό κομματάκι, υβριδίζεται μόνο με τους γωνιδιωματικούς κλόνους Σ και Δ. Σε ποιο τμήμα του χρωμοσώματος τρία βρίσκεται? Στο τέσσερα. Γιατί εφόσον υβριδίζεται εδώ πέρα, άμα ήταν εδώ πέρα θα είχαμε στο τρία, άμα είναι στο πέντε είναι εδώ, άρα αναγκαστικά είναι στην περιοχή τέσσερα. Και αν ένα ΣΤΕΣ, δηλαδή πάλι ένα μικρό κομματάκι, μια κουκίδα, υβριδίζεται μόνο με ένα γωνιδιωματικό κλόνο, σε ποια τμήματα του χρωμοσώματος τρία μπορεί να βρίσκεται? Στο ένα που μόνο εδώ πέρα έχουμε αυτή την περιοχή, στο έξι που μόνο αυτή την περιοχή έχουμε και στο δέκα που μόνο αυτή την περιοχή έχουμε. Με αυτές τις ασκήσεις, σκοπός είναι να καταλάβετε αλληλεπικάλυψη κλόνων και σχετική τοποθέτηση θέσεων σημεών επάνω σ'αυτούς τους κλόνους, επάνω σ'αυτούς τους φυσικούς χάρτες, εντάξει. Επαναλαμβάνω, σκοπός μου πάντα μόλις αυτές τις ασκήσεις είναι να καταλάβετε τι σημαίνει αλληλεπικάλυψη κλόνων και γιατί φτιάχνουμε τους φυσικούς χάρτες, ώστε να έχετε στους αμοιολόγους σας στην οργάνωση του γονιδιώματος, στην οργάνωση των κλόνων. Τώρα, ξεκινήσαμε από την απλή την άσκηση όπου είχατε βάλει, σας δίνουμε ήδη τους κλόνους της αλληλεπικάλυψης μεταξύ των κλόνων και τώρα θέλουμε να τους βρείτε εσείς αυτές τις αλληλεπικάλυψεις. Αυτό είναι ένα τσικ πιο δύσκολη αυτή η άσκηση. Και πώς θα το κάνετε αυτό. Έχεις πέντε κλόνους από A-E, γιάξιν αυτή η κλόνη, τους οποίους θες να φτιάξεις το φυσικό χάρτη και την αλληλεπικάλυψη χρησιμοποιώντας την τρίτη τεχνική που είπαμε πιο πριν, δηλαδή υβριδισμό με STS. Και βλέπουμε τα αποτελέσματα σε αυτόν τον πίνακα. Όπου βλέπεις ας πούμε ο τόπος STS-1 έδωσε θετικό αποτέλεσμα στους κλόνους για Α και Δ. Τι καταλαβαίνετε από αυτό αμέσως αμέσως ότι ο Α και ο Δ, ο κλόνος είναι ελεπικαλυπτόμενοι. Εντάξει. Άρα, θέλουμε με βάση αυτές τις πληροφορίες να σχεδιάσετε τον CONTIC χάρτη που προκείται από τις συνένωσες των κλόνων. Βάλτε τους σε μια σειρά τους κλόνους και πάνω σε αυτή τη σειρά των κλόνων τοποθετήστε και τις θέσεις των STS. Είπαμε ότι όπου βλέπεις συν σημαίνει ότι έχει θετικό αποτέλεσμα. Ο STS-2 υπάρχει μόνο στον κλόνο Δ, για παράδειγμα. Κρατάτε στο μυαλό σας πάντα ότι αυτές είναι θέσεις, κουκίδες και αυτή είναι κλόνη τεράστιες τετμήματα μεγάλες γραμμές ας πούμε. Έχετε χαρτί και μολύβι. Το STS-3 και το STS-4 που είναι δίπλα δίπλα δεν έχουν καμπώ. Το STS-3 για παράδειγμα και το STS-4 βλέπεις ότι υβριδίζεται στο Ε και στο Σ αλλά βλέπεις ότι το STS-3 υβριδίζεται και στο Υ που το 4 δεν υβριδίζεται στο Υ. Το πιο απλό είναι συνήθως να ξεκινήσετε από ένα δικτύ που υπάρχει μόνο σε έναν κλόνο για να μην το πεδέψετε. Το πιο εύκολο είναι να ξεκινήσεις από τον δικτύ 2 ο οποίος ενισχύεται μόνο στον κλόνο Δ. Και πού το ξέρεις ότι είναι 1-4-3 και δεν είναι 1-3-4. Δεν το ξέρεις ακόμα. Βάλε λίγο χώρο γιατί μετά θα χρειαστείς χώρο. Πέντε και ένα. Σίγουρα το πέντε είναι πιο εδώ γιατί αν ήταν από εδώ θα πρέπει να υπάρχει και στον α. Από εδώ το Σ θα βάλουμε εδώ. Το τέσσερα θα είναι 3-6. Τράβω το πιο μετά, τράβω, τράβω, τράβω, μην το φοβάσαι. Εδώ περίπου. Βάλτο εκεί. Και επίσης αυτό καλύτερα κάνε το λίγο εδώ πέρα για να μην πέφτει κάτω από το 1. Και το 2. Ακόμα δεν μπορείς να το βάλεις μόνο το 2. Άστο. Βάλε το ί πρώτα απ' όλα. Το γκλώνω. Πέσσερα και τρία και έξι. Ποιο είναι το ί? Τρία και έξι. Τρία και έξι. Ωραία. Θα το βάλω από εδώ. Βάλ' το. Βάλ' από εκεί πέρα τρία και έξι. Το ί. Τράβα λίγο γραμμή εδώ πέρα κάτω κάπου. Κάπου. Ναι. Τρία και έξι. Ωραία. Το ί. Το ί. Και τώρα το δι. Και το δι είναι 2 και 5. 2 και 5. Άρα. Εδώ. Άρα θα βάλεις το δι. Το 2. Και 5. Τώρα. Ξεκίνησες λίγο ανάποδα. Ναι. Δηλαδή το πιο απλό είναι να ξεκινήσεις από τους δίκτες και όχι από τους κλόνους. Δηλαδή εσύ ξεκίνησες από τους κλόνους και εκεί πάνω έβαλες τους δίκτες. Πιο εύκολο είναι να ξεκινήσεις από το δίκτυ και να πεις ο δίκτης 2 υπάρχει μόνο στον κλόνο Ν. Βάζω λοιπόν το ν 2 και τι άλλο βρίσκω επίσης στο ν το 5. Οπότε μετά το πας ας πούμε όπως είπαμε με τις ελεπικαλίψεις μετά πας ο 5 που όλου κολλάει στο β. Άρα θα βάλεις το 5 το β και τώρα θα βάλεις το β και το ν λίγο πιο κάτω. Και έτσι πάει. Δηλαδή ξεκινάς από το ν 2 5 το 5 επίσης το βρίσκω και στο β. Β 51. Οπότε μετά το πας έτσι. Έτσι. Εντάξει. Το καταλάβατε. Καμιά ερώτηση. Αφού το καταλάβατε αυτό να κάνουμε και το ένα κλικ ακόμα πιο δύσκολο. Δηλαδή με αυτή τη λογική το πιο όμορφο είναι αυτό να καταλήξετε σε κάτι τέτοιο. Δεν έχω τραβήξει τις γραμμές αλλά πάντως μια χαρά μετά θα μπορέσετε να βάλετε αυτούς τους κλόνους. Εντάξει. Έτσι και εγώ θα τα βάλω και στο ίντερνετ αυτά. Και εδώ το κάνουμε πιο δύσκολο. Εδώ πέρα δεν είναι δεδομένο. Πρώτα απ' όλα εδώ πέρα δεν έχουμε δίκτες και κλόνους. Έχουμε απλώς τους κλόνους τους οποίους τι κάνουμε. Το μόνο που κάνουμε είναι να τους συμφριδίζουμε μεταξύ τους. Λοιπόν μιλάμε για σειρές γραμμές οι οποίες είναι αλυπκαλυπτόμενες. Αλλά δεν είναι δεδομένο ότι όλοι οι κλόνοι αποτελούν το ίδιο χρωμόσομα το ίδιο κόντιγκ. Μπορεί να κάποιοι να συμφριδίζονται μεταξύ τους και κάποιοι άλλοι με κάποιους άλλους. Δηλαδή να έχουμε κενά στα χρωμόσώματα. Άρα λοιπόν εδώ πέρα τι σας λέει ότι έχουμε 11 κλόνους από το χρωμόσωμα 4 της Δροσόφυλλης Μελανόγκάστερ και προσπαθείς να τους βρεις στις αλυπκαλύψεις τους, να βρεις δηλαδή τα κόντιγκ με αλλιπάλους συμφριδισμούς. Και κάθε φορά που υβριδιζόταν ο κλόνος ας πούμε με κάποιον άλλο ΚΑΠΑ με τον ΕΠΣΜΕΤ, τότε έχουμε σύν. Πώς είναι τα κόντιγκ και ποια είναι η σειρά των κλόνων σε αυτά τα κόντιγκ. Άρα λοιπόν εδώ πέρα έχετε δύο διαφορετικά πράγματα. Να δείτε τις ομάδες των κλόνων που υβριδίζονται μεταξύ τους και μετά να τους βάλετε σε μια σειρά. Άρα αρχικά δεν χρειάζεται να παιδευτείτε, όταν αρχίσετε να βάζετε τα κατευθύνσια στη σειρά, μπορείτε να ξεκινήσετε και να πείτε. Εδώ βλέπετε ότι είναι ένας διαγώνιος πίνακας που σημαίνει ότι συγκρίνει στο κάθε τίμι τον εαυτό του. Και για να μην επαναλαμβανόμαστε με τα ίδια τα αποτελέσματα πώς πάμε, βλέπουμε για παράδειγμα. Εδώ πέρα είναι εύκολο να καταλάβεις τι γίνεται, γιατί εδώ πρέπει να έχεις τη σύγκριση του Κ με όλους τους κλόνους και βλέπεις τι γίνεται. Τον J για να δείτε με ποιους υβριδίζεται, πας έτσι και μετά πας προς τα πάνω. Δηλαδή για τον Κ την υβριδισμό δεν το έχει εδώ πέρα το αποτέλεσμα, αλλά πας έτσι. Για τον G για παράδειγμα, το αποτέλεσμα του υβριδισμού έχεις η σύγκριση με το Α, με το Β, με το Σ, πάμε έτσι. Ο πίνακας αυτός να συνεχίζει και έτσι, αλλά θα ήταν επανάληψη των αποτελεσμάτων, άρα αντί να συνεχίσουμε έτσι μετά πάμε προς τα πάνω. Οπότε μετά βλέπουμε στην οριζόντια τη σύγκριση του G με τους κλόνους από Α μέχρι Φ και στην κατακόρυφη τη σύγκριση του G με τους κλόνους H μέχρι Κ. Έγινε και να καταλάβετε πώς το διαβάζουμε αυτό το πίνακα. Και τώρα, αυτό που μπορείτε να κάνετε λοιπόν είναι, πρώτα είπαμε ότι θέλουμε να δούμε αν όλοι οι κλόνοι μας αποτελούν έναν κόντιγγ. Αν όλοι οι κλόνοι μας αποτελούν έναν κόντιγγ, τότε θα πρέπει, όταν αρχίσουν να ψάχνουν τους υβριδμούς, θα πρέπει ο Α να υβριδίζεται με τον Σ, ο Σ με τον Υ, ο Υ με τον παραπάνω και να τους βρείτε όλους μαζί. Άρα αυτό που το οποίο πρέπει να ξεκινήσετε είναι, να πείτε, ο Κ υβριδίζεται με τον Υ, γράφουμε τώρα ομάδα Κ, κ, Υ. Ο Ε υβριδίζεται με τον Ά, τον βάζουμε και αυτόν στην ομάδα. Με άλλον υβριδίζεται ο Ε, φτάμε εδώ, πάμε έτσι, δεν υβριδίζεται. Μετά παίρνουμε τον Ά και ούτω καθεξής. Έτσι θα βρούμε κατά πόσο έχουμε μία ομάδα ή περισσότερες ομάδες. Προσπαθήστε να το κάνετε αυτό πρώτα απ' όλα και μετά βάλτε σε σειρά τους κλόνους. Για την ώρα βρείτε μου πόσες ομάδες από κλόνους έχουμε. Πόσα κόντιγγ δηλαδή έχουμε. Με αυτόν τον τρόπο που σας έδειξα. Ο Κ με τον ε, ο ε με τον Ά, ο Ά με ποιους και απλώς θα τους γράφετε. ΚΑΠΑΚΩΜΑ, ΕΠΣΙΛΟΝΚΩΜΑ, ΆΙΚΩΜΑ.