Κυτταρική βιολογία / Διάλεξη 5 / 5η Διάλεξη - Παναγιωτίδης Χρήστος (ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ, 2014)
5η Διάλεξη: το θέμα της σημερινής μιλίας έχει να κάνει μία από τις πιο σημαντικές διαδικασίες που γίνονται στα κύτταρα. Έχει να κάνει με τη μεταγραφή αλλά και με τη ρύθμιση της μεταγραφής και τους παράγοντες που την επηρεάζουν. Θα μιλήσουμε για το πώς θα είναι η κυβερνή της κυβερνήσης, το πώς θα είναι η μεταγραφή αλλά και με τη ρύθμιση της μεταγραφής και τους παράγοντες που την επηρεάζουν. Θα μιλήσουμε για μερικά κύρια σημεία σήμερα, τα οποία έχουν να κάνουν πρώτα με τη σχέση μεταξύ γωνιδιακής οργάνωσης και μεταγραφής, θα δούμε και τη γωνιδιακή οργάνωση αλλά και το πώς η δομή της χρωματίνης μπορεί να επηρεάσει την έκφραση γενικού υλικού. Θα μιλήσουμε λίγο για τη μεταγραφή του DNA σε RNA, θα δούμε τι είναι. Θα μιλήσουμε για τα έζημα τα οποία μπλέκονται σε αυτή την δικασία, τις RNA πολυμεράσεις. Θα δούμε πώς αναγνωρίζουν τα σημεία από τα οποία ξεκινούν, τα οποία θα λέμε υποκινητές. Θα μιλήσουμε για διάφορους παράγοντες, μεταγραφικούς παράγοντες που μπορούν να ρυθμίσουν τη δράση των RNA πολυμερασών και θα δούμε τη διαφορά μας και των γενικών και των ρυθμιστικών μεταγραφικών παραγόντων. Θα μιλήσουμε για τη ρύθμιση φυσικά της μεταγραφής. Θα μιλήσουμε για το ρόλο της χρωματίνης στην έκφρασης γενικής υπτοφορίας στη μεταγραφή. Θα δώσουμε μία ιδέα για το πώς μπορεί να γίνει η κληρονομίσιμη απενεργοποίηση της γενειακής έκφρασης αλλά και ο ρόλος της μεθυλιούς DNA και στο τέλος θα μιλήσουμε για την ορήμανση των αγγελιοφόρων RNA των εφερειοτικών οργανισμών τα οποία όπως θα δούμε χρειάζεται να ορυμάσουν πριν να είναι έτοιμα να οδηγήσουν στη σύνθεση νεών πρωτεϊνών. Μεταγραφή τι είναι όπως θα δούμε είναι η διαδικασία με την οποία με μήτρα DNA σχηματίζονται μόρια RNA αλλά όπως σας είπα και προηγουμένως το DNA δεν είναι γυμνό το DNA μέσα στο κύτταρο και όπως έχουμε πει και άλλες φορές ανεξάρτητα μιλάμε για προχαριωτικά κύτταρα ή για ευχαριωτικά κύτταρα το DNA δεν είναι γυμνό είναι πάντα σύμπλοκο με πρωτεΐνες το σύμπλοκο το λέμε χρωματίνη και σίγουρα η ύπαρξη αυτού των πρωτεϊνών μπορεί να επηρεάσει είτε αρνητικά είτε θετικά την έκχραση γενικής πληροφορίας δηλαδή την μεταγραφή. Επίσης πέρα από την οργάνωση του DNA και του γενικού υλικού σε χρωματίνη υπάρχει και η γονιδιακή οργάνωση ο τρόπος λοιπόν με τον οποίο είναι οργανωμένα χτισμένα τα γονίδια στους διάφορους οργανισμούς. Θα πούμε λοιπόν το πως είναι οργανωμένη αυτή η γενική πληροφορία και θα δώσουμε κάποιες πληροφορίες για διαφορές που υπάρχουν στην οργάνωση της γενικής πληροφορίας μεταξύ ευχαριωτών και προχαριωτών και θα δούμε αν αυτές οι διαφορές στην οργάνωση έχουν και κάποια αποτελέσματα κάποια επίδραση πάνω στη γονιδιακή έκφραση και στους μηχανισμούς που χρησιμοποιούνται στους διάφορους οργανισμούς για να εκφράσουν τα γονίδια τους. Το πρώτο πράγμα το οποίο βλέπουμε όταν συγκρίνουμε τη γονιδιακή οργάνωση σε προκαριώτες και ευχαριώτες είναι κάτι πολύ απλό. Βλέπουμε ότι στους προκαριώτες υπάρχει μια αλληλουχία όπου θα ξεκινήσει η μεταγραφή, μια αλληλουχία όπου θα τελειώσει η μεταγραφή και ένα ενδιάμεσο μέρος το οποίο μπορεί να περιέχει ένα ή περισσότερα γονίδια το οποίο αφού μεταγραφεί θα δώσει έναν γελειοφόρο ανέει το οποίο μπορεί να μεταφραστεί. Πάρα πολύ απλά. Στους ευχαριώτες εντίθετα βλέπουμε ότι τα γονίδια δεν είναι τόσο απλά. Πάλι υπάρχει μια αλληλουχία έναρξης της μεταγραφής, μια αλληλουχία λήξης. Αλλά αν δούμε το ενδιάμεσο βλέπουμε ότι το ενδιάμεσο RNA δεν κωδικοποιεί πάντα προτείνει και μπορούμε να το διαχωρίσουμε σε εξόνια και ιντρόνια και όπως θα δούμε τα εξόνια θα παραμείνουν στο όριμα γελειοφόρο RNA ενώ τα ιντρόνια θα απομακρυθούν και αφού απομακρυθούν τα ιντρόνια και ενωθούν τα εξόνια βλέπουμε ότι ακόμα και η πληροφορία που βρίσκεται μέσα στα εξόνια δεν είναι όλη αυτή η πληροφορία η οποία θα μας οδηγήσει στην κωδικοποίηση προτείνεις. Δηλαδή θα δούμε ότι υπάρχουν και στο πέντε άκρο του mRNA και στο τρίο άκρο κάποιες αμετάφρασης περιοχές, αμετάφρασης δεν σημαίνει ότι δεν έχουν και σημαντικούς βιολεγικούς ρόλους αλλά δεν καθοδηγούν τα ριβοσώματα να συνθέσουν κάποιες προτείνες και βλέπουμε βέβαια ότι οι περιοχές του όριου mRNA οι οποίες κωδικοποιούν προτείνες είναι αυτές οι οποίες θα καθορίσουν την πρωτοταγή δομή δηλαδή την αλληλουχία των αμυνοξέων των πρωτεϊνών που θα προκύψουν μετά από μετάφραση του συγκεκριμένου αγγελιοφόρου RNA. Άρα με δομένη την οργάνωση και τις διαφορές στην οργάνωση που είδαμε μεταξύ προκαριωτών και ευχαριωτών αν κοιτάξουμε το δόγμα της μορικής βιολογίας μπορούμε να το εξειδικεύσουμε κάποιο τρόπο. Η απάντηση είναι ναι. Αν κοιτάξουμε τα προκριωτικά κύτερα επειδή τα γωνίδια τους δεν είναι διακοπτόμενα τότε εκεί μπορεί να πούμε πράγματι ότι το DNA κάνει RNA αυτό το RNA είναι αγγελιοφόρο RNA και θα μεταφραστεί σε πρωτεΐνη ή σε πρωτεΐνες όπως είπαμε ανάλογα εάν το mRNA είναι μόνο κυστρονικό ή πολύ κυστρονικό. Μια πρωτεΐνη ή περισσότερες. Αντίθετα αν κοιτάξουμε στα βιολογικά κύτερα βλέπουμε δύο πράγματα. Πρώτα πρώτα βλέπουμε ότι το DNA γενική πληροφορία βρίσκεται μέσα στον πυρήνα και δεν είναι μέσα στο κυταρόπλασμα όπως τους προκαριώτες. Τι άλλο βλέπουμε? Βλέπουμε ότι το προϊόν της μεταγραφής δεν είναι αγγελιοφόρο RNA. Είναι ένα πρωτογενές RNA μετάγραφο το οποίο όπως είπαμε περιέχει τις αλληλουχίες των εξωνίων και των ιδρωνίων. Αυτό το πρωτογενές RNA μετάγραφο το οποίο δεν είναι αγγελιοφόρο RNA για να γίνει όρημο αγγελιοφόρο RNA το οποίο αφού οριμάσει θα μιλήσει ο κυταρόπλασμα και θα μεταφραστεί πρέπει να οριμάσει με κάποιο τρόπο και συγκλιμένα με τρεις διαφορετικούς τρόπους. Θα δούμε ότι πρέπει να γίνουν κάποιες αλλαγές στην αρχή του στο πέντε άκρο του όπου θα προσθεθεί μια καλύπτρα. Θα πούμε αργότερα τι είναι αυτή η καλύπτρα. Θα πρέπει να γίνουν κάποιες αλλαγές στο τρία άγροντος ο τέλος δηλαδή όπου θα προσθεθεί και μια ουρά πολυαδενειλικού ένα πολυέι και φυσικά όπως είπατε και προηγουμένως θα πρέπει να αποκοπούν τα ιδρώνια και να ενωθούν μεταδεξί τους τα εξόνια και όταν γίνουν και αυτές οι τρεις διαδικασίες δηλαδή προσθήκη καλύπτρας, προσθήκη πολυαϊούρας, απομάκρυση ιδρωνίων και ένωση εξονίων τότε και μόνο τότε το αγγελιοφόρο αρενέι μας θα είναι αγγελιοφόρο αρενέι όριμο για να βγει από τον πυρήνα και να οδηγηθεί στον κυταρόκλασμα όπου θα μεταφραστεί. Άρα λοιπόν βλέπουμε κάποιες βασικές διαφορές μεταξύ προχαριοδικών και ευχαριοδικών κιτάρων. Αλλά ας ξεκινήσουμε λιγάκι σκεπτόμενοι γιατί πρέπει να υπάρχει αυτή η διαδικασία της μεταγραφής. Γιατί πρέπει να υπάρχει οπωσδήποτε ένα αγγελιοφόρο αρενέι προκειμένου να εκφραστεί γενική πληροφορία και δεν εκφράζεται κατευθείαν από το DNA. Αυτό που βλέπουμε είναι ότι η γενική πληροφορία, το DNA λοιπόν, είναι σαν ένα σκληρό δίσκο που αν αυτός ο σκληρός δίσκος ήταν προσβάσιμος συνεχώς θα υπήρχε πολύ μεγάλη πιθανότητα να σημούν κάποια λάθη και να τον καταστρέψουν. Αυτό είναι το ένα. Αλλά είναι και το πιο απλογικό ίσως. Γιατί αν κοιτάξουμε τη δομή του DNA θα δούμε ότι αυτή η δομή του DNA δεν επιτρέπει ούτε τη μεταφορά του, ο οποίος όπως είπαμε ειδικά σε οφεαριότητες το DNA αποτελείται από δίκλωνα γραμμικά μόρια μεγάλο μήκους, τα οποία φυσικά δεν μπορούν να μπαινουν βγαίνουν από τον πυρήνα. Αλλά εκτός από αυτό, αυτό που βλέπουμε είναι ότι επειδή το DNA είναι δίκλωνο, οι βάσεις του είναι ζευγαρωμένες με τις απέναντι βάσεις, τις βάσεις δηλαδή, το απέναντι κλώνο. Άρα δεν μπορούν να ζευγαρώσουν με άλλα νοικλειοτήδια κάτι το οποίο είναι τελείως απαραίτητο για την έκφραση της γενετικής πληροφορίας στη διαδικασία της μετάφρασης. Όπου θα πρέπει αυτή η γενετική πληροφορία να αποκωδικοποιηθεί και να μας δώσει κάποιες πρωτεΐνες που ουσυστικά είναι αλληλουχίες αμίνοξεων. Λοιπόν, άρα λοιπόν το DNA δεν έχει δυνατότητα ούτε να μεταφερθεί ούτε να μεταφραστεί. Άρα τι μπορεί να γίνει. Αυτό το οποίο ο Μπονό υπέθασε και φυσικά είχε δίκιο στη δεκαετία του 60 ήταν ότι υπάρχει ένα ενδιάμεσο μόριον το οποίο θεώρησε τότε και πάλι είχε δίκιο ότι δεν είχε μεγάλη διάρκεια ζωής, ήταν ένα ευαίσθητο μόριον το οποίο το ονόμασε Αγγελιοφόρο Αρενέικ και είναι αυτό το οποίο θα μετέφερε το μήνυμα από το DNA στα ριβοσώματα όπου θα γινόταν η αποκωδικοποίηση. Λοιπόν, η ερώτηση είναι πως συντίθεται αυτό το ενδιάμεσο μόριο και ποιοι παράγοντες καθορίζουν το πότε θα συνδεθεί, την ποσότητα στην οποία θα συνδεθεί και αυτά. Λοιπόν, ξεκινήσουμε πρώτα μιλώντας για την διαδικασία της μεταγραφής αυτή κατά αυτή που πρέπει να την καταλάβουμε. Τι είναι μεταγραφή λοιπόν? Μεταγραφή είναι η παραγωγή μορίων RNA χρησιμοποιώντας το DNA σαν μήτρα. Εάν το κοιτάξουμε αυτό βλέπουμε ότι υπάρχουν κάποιες διαφορές, δηλαδή δούμε μία μία, μεταξύ της μεταγραφής και της αντιγραφής που είδαμε στην προηγούμενη διάλεξη. Λοιπόν, ποιες είναι αυτές, για παράδειγμα. Μόνο η μία αλυσίδα του DNA χρησιμοποιείται σαν μήτρα. Στην αντιγραφή χρησιμοποιήθηκαν και οι δύο. Η αλληλουχία των βάσεων του παραγωμένου μορίου RNA είναι συνδροματική μόνο της μίας αλυσίδας του DNA, της αλυσίδας μήτρας. Θα δούμε αργότερα ότι το ένζιμο το οποίο εμπλέκεται σε αυτή τη διαδικασία, δηλαδή στη σύνθεση εγγυλιοφόρου RNA με χρήση DNA μήτρας, λέγεται RNA πολυμεράση. Σε αντίθεση με την DNA πολυμεράση που είδαμε στην προηγούμενη διάλεξη, η οποία μπορούσε να καταλαβαίνει πότε έκανε λάθη και να τα διορθώνει, η RNA πολυμεράση δεν διορθώνει τα λάθη της. Τι χρειάζεται όμως για να γίνει αυτή η μεταγραφή. Είπαμε λοιπόν ότι χρειάζεται να υπάρχει μήτρα DNA. Χωρίς DNA δεν γίνεται μεταγραφή. Χρειάζεται το ένζιμο το οποίο θα καταλύσει αυτήν την αντίραση. Αυτό το ένζιμο είναι η RNA πολυμεράση. Θα δούμε ότι σε αυκαριότητες υπάρχουν περισσότεροι από τα RNA πολυμεράσεις με εξειδικαιμένες λειτουργίες. Τι άλλο χρειάζονται. Το RNA είναι πολυμερές. Άρα χρειάζονται οι δομικοί ληθοί, για τους οποίους θα χτιστεί αυτό πολυμερές. Τα μονομεροί. Αυτά τι είναι. Είναι τα τριφωσφορικά ρίβο νουκλιοτίδια. Αλλά εκτός από όλα αυτά εδώ χρειάζονται και μικρομωριακοί και μεγαλομωριακοί παράγοντες, που θα διευκολύνουν την RNA πολυμεράση. Μικρομωριακοί παράγοντες, για παράδειγμα, είναι διάφορα κατιώντα, είτε ανόργανα, όπως τα γιώντα μαϊνισίου, είτε οργανικά, όπως οι πολυαμίνες, που έχουν αυτό κοινό χαρακτηριστικό, ότι είναι κατιώντα, άρα εξωτερώνουν τα αρνητικά φορτία του DNA και διευκολύνουν την αντίδραση της μεταγραφής. Ταυτόχρονα, όμως, χρειάζονται μεγαλομωριακοί παράγοντες, τι μεγαλομωριακοί παράγοντες, κυρίως πρωτεΐνες, αλλά όχι αποκλειστικά, που είναι απαραίτητοι και για τη δράση, είτε για τη δράση, είτε για τη ρύθμιση της RNA πολυμεράσης ή των RNA πολυμερασών. Λοιπόν, αν κοιτάξουμε την αντίδραση της μεταγραφής και κοιτάξουμε και το ένζυμο, την RNA πολυμεράση, τι βλέπουμε, βλέπουμε ότι η RNA πολυμεράση, καθώς προχωρά και μεταγράφει και φτιάχνει ένα νέο RNA μετάγραφο, δημιουργεί μια τοπολογική ανομαλία στο DNA. Δηλαδή βλέπουμε τοπικά να ξεδιπλώνει το DNA στο σημείο όπου μεταγράφει, αλλά καθώς προχωράει, βλέπουμε ότι αυτή η φούσκα, αυτό το άνοιγμα, συνεχίζει να προχωράει, ενώ το DNA το οποίο έχει ήδη μεταγραφεί, επαναδιπλώνεται. Αυτό είναι τελείως διαφορετικό από αυτό που είδαμε στις αντιγραφήσεις του DNA, όπου η φούσκα της αντιγραφής, η τηχάλα της αντιγραφής, όλο και μεγάλωνε όσο αντιγράφονταν το DNA. Τι άλλο βλέπουμε εδώ, βλέπουμε ότι είναι εξαιρετικά σημαντικό το RNA μετάγραφο στην άκρη του να είναι υβρισμένο με το κλώνο του DNA που είναι μήτρα. Εντάξει, αυτό γιατί, γιατί αυτό όμως δίνει το τρία υδροξύλιο στο σωστό σημείο, δηλαδή δίπλα στην επόμενη βάση του DNA, στην οποία θα ζευγαρώσει ένα ρίβο νουκλαιοτήδιο, το οποίο κατόπιμ με δράσεις RNA πολυμεράσεις θα ενσωματωθεί στο RNA. Μια διαφορά που βλέπουμε μεταξύ της δράσης RNA πολυμεράσεις και αυτής της DNA πολυμεράσεις, είναι ότι εδώ δεν βλέπουμε να υπάρχουν υλικά συμπροστά η οποία να αποελικώνει το DNA, αυτό μπορεί να το κάνει η ίδια η RNA πολυμεράση. Εδώ βλέπουμε όμως την RNA πολυμεράση σε μια διαδικασία όπου η μεταγραφή έχει ήδη ξεκινήσει, είναι κάπου στο μέσο ενός γωνιδίου. Ξεκινάει τυχαία η RNA πολυμεράση, η μεταγραφή, η απάντηση είναι πως όχι. Η απάντηση είναι πως όχι γιατί υπάρχουν ειδικές αλληλουχίες στις οποίες μπορεί να ξεκινήσει η RNA πολυμεράση και ειδικές αλληλουχίες στις οποίες γνωρίζει ότι πρέπει να σταματήσει. Άρα θα πρέπει να καταλάβουμε ότι τα γωνίδια, οι περιοχές, οι μεταγραφικές μονάδες γενικά, οριοθετούνται από κάποιες αλληλουχίες DNA οι οποίες θα προσελκύσουν την RNA πολυμεράση έτσι ώστε να ξεκινήσει σε καθορισμένα σημεία και κάποιες άλλες αλληλουχίες στις οποίες θα σταματήσει η RNA πολυμεράση. Αυτό το δούμε και παραπάνω και θα δούμε ότι αυτές οι αλληλουχίες είναι πολύ συγκεκριμένες, είναι διαφορετικές προκαριώτες από τους ευκαριώτες και έχουνε κάποιες ομοιότητες μεταξύ τους. Θα ταρχάς όμως να δούμε την μεταγραφή. Η μεταγραφή δεν είναι μια διαδικασία η οποία είναι αφιριμένη. Μπορούμε στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο όπως βλέπουμε εδώ να δούμε ολόκληρα γωνίδια. Σε αυτήν την περίπτωση βλέπουμε ορισμένα ριβοσωμικά DNA, δηλαδή περιοχές του DNA που κωδικοποιούν ριβοσωμικά RNA, δηλαδή RNA τα οποία αποτελούν συστατικά των ριβοσωμάτων. Και αυτό που βλέπουμε είναι αυτά τα ξενιάτικα δέντρα ταπλαγιασμένα όπου στην αρχή τα κλαδάκια τους, εκεί που ξεκινάει η μεταγραφή είναι κοντά και καθώς προχωράει η RNA πολυμεράση τα κλαδιά τους, τα οποία σε αυτήν την περίπτωση δεν είναι κλαδιά αλλά είναι τα RNA τα οποία συνδέεται είναι όλο και μεγαλύτερα. Βλέπουμε λοιπόν ότι όσο προχωράει προς το τέλος του γωνιδίου η RNA πολυμεράση τόσο το μήκος του προϊόντος, το μήκος του RNA γίνεται όλο και μεγαλύτερο. Τι άλλο βλέπουμε αυτό το οποίο μας λέει αυτή η διαφάνεια είναι το εξής μας λέει επίσης ότι ένα γωνίδιο, μια μεταγραφική μονάδα δεν μεταγράφεται από μια RNA πολυμεράση τη φορά. Δηλαδή τι σημαίνει αυτό ότι η RNA πολυμεράση όπως είπαμε θα αναγνωρίσει ένα υποκινητής στον οποίο θα συνδεθεί και θα ξεκινήσει. Με το που αδειάσει αυτός ο υποκινητής υπάρχει δυνατότητα ένα άλλο μόριο RNA πολυμεράση να συνδεθεί και να ξεκινήσει με τα γραφή και αμέσως μετά και άλλο και άλλο και άλλο και άλλο. Επομένως γωνίδια τα οποία εκφράζονται έντονα έχουν υποκινητές οι οποίοι μπορούν να προσερκίσουν με μεγαλύτερη ευκολία τα μόρια της RNA πολυμεράσης από άλλους οι οποίοι δεν εκφράζονται τόσο έντονα. Ας δούμε λιγάκι όμως και τις RNA πολυμεράσες που είναι τα ένζυμα τα οποία επιτελούν την μεταγραφή. Το πρώτο πράγμα το οποίο βλέπουμε είναι ότι οι RNA πολυμεράσες είναι μεγάλα ένζυμα και είναι πολύ πλόκα ένζυμα. Δεν αποτελούνται από μία πολυπτητική αλυσίδα αλλά από αρκετές. Ακόμα και οι βακτηριακές RNA πολυμεράσες που είναι απλούστερες αποτελούνται από πέντε υπομονάδες τη βΒ τόνος, δύο υπομονάδες α και μία υπομονάδα σ, που αυτή η υπομονάδα σ είναι αυτή που τους προσδίδει την ικανότητα να συνδέονται, να αναγνωρίζουν και να συνδέονται στον υποκινητή. Υπάρχει μία βακτηριακή πολυμεράση, δεν θα πούμε πολλές λεπτομέρειες αλλά ίσως σε άλλες διαλέξεις, η μοριακή βιολογία, θα μιλήσουμε ότι υπάρχουν πολλοί παράγοντες σ, όχι μόνο ένας, οι οποίοι αναγνωρίζουν διαφορετικούς βακτηριακούς υποκινητές. Εάν κοιτάξουμε όμως τώρα τις ευχαριώτες, βλέπουμε ότι δεν έχουν σαν τα βακτήρια μόνο μία RNA πολυμεράση αλλά έχουνε περισσότερες από μία. Συγκεκριμένα έχουνε τρεις. Κάθε μία από τις RNA πολυμεράσες των ευχαριωτών έχει μία εξειδικευμένη λειτουργία. Για παράδειγμα η RNA πολυμεράση 1, κατά κύριο λόγο μεταγράφει τα ριβοσωμικά γωνίδια. Δηλαδή είναι υπεύθυνη για τη σύνθεση των ριβοσωμικών RNA. Από την άλλη μεριά η RNA πολυμεράση 3, εμπλέκεται κυρίως στην μεταγραφή των γωνιδίων των tough RNA αλλά και ενός μικρού ριβοσωμικού RNA του 5S. Πιο ενδιαφέρουσα φυσικά είναι η RNA πολυμεράση 2, η οποία είναι αυτή η οποία μεταγράφει τα γωνίδια τα οποία κωδικούν πρωτεΐνες που είναι τα περισσότερα και τα πολυπλοκότερα. Και στις τρεις περιπτώσεις και οι τρεις RNA πολυμεράσες των ευχαριωτών και η 1 και η 2 και η 3 δεν έχουν ιδέα που είναι ο υποκινητής. Άρα δηλαδή αν τις πάρουμε μόνοι τους παρά το ότι είναι μεγάλες και αποτελούνται από πολλές υπομονάδες πόσες για παράδειγμα η RNA πολυμεράση του ανθρώπου αποτελείται από πάνω από 18 πρωτεΐνικές υπομονάδες. Παρ' όλα αυτά όμως παρά την πολυπλοκότητά της δεν μπορεί να γνωρίσει έναν ευχαριωτικό υποκινητή. Για να γίνει αυτό εδώ χρειάζεται να έχει βοήθεια από κάποιες άλλες πρωτεΐνες που τις λέμε γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Η RNA πολυμεράση 2 για να γνωρίσει τον υποκινητή χρειάζεται ένα μεταγραφικό παράγοντα το οποίο το λέμε TF2D δηλαδή μεταγραφικό παράγοντα της πολυμεράσης 2D. Λοιπόν το ίδιο συμβαίνει και στην RNA πολυμεράση 1 και 2 που και αυτές χρειάζονται μεταγραφικούς παράγοντες προκειμένου να αναγνωρίσουν τους αντίστοιχους υποκινητές τους οι οποίοι βέβαια έχουν διαφορετικές αλληλουχίες από τους υποκινητές των γονηδίων που μεταγράφονται την RNA πολυμεράση του 2. Θα ξαναγυρίσουμε σε αυτό αλλά πρώτα ας ξεκινήσουμε απλά. Αυτό που βλέπουμε εδώ είναι βλέπουμε τη διαδικασία της προχαριωτικής μεταγραφής και στην αρχή να κοιτάξουμε τη μεταγραφική μονάδα και βλέπουμε ότι αυτή εδώ οριοθετείται όπως είπαμε από αλληλουχίες έναρξης της μεταγραφής τον υποκινητή και από αλληλουχίες λήξης. Οι αλληλουχίες έναρξης της μεταγραφής ο υποκινητής αποτελείται από δύο διακριτά στοιχεία τα οποία τα λέμε μειον 10 και μειον 35 γιατί βρίσκονται είτε 10, 10 και 35 νουκλαιοτήδια ανωδικά πριν από το σημείο έναρξης της μεταγραφής. Δηλαδή από εκεί που θα αρχίσει να συντίθεται το RNA. Η RNA πολυμεράς συνήθως μέσα σε έναν βακτριακό κύταρο δεν ελεύθερη στο κυτερόπλασμα. Βρίχεται συνδεδεμένη αλλά όχι πολύ ισχυρά πάνω στο DNA πάνω στη βακτριακή χρωματίνη και τη σκανάρει. Χλιστράει πάνω σε αυτή. Όταν όμως έρχεται σε επαφή βρει έναν υποκινητή τότε αμέσως αμέσως καθυστερεί. Μένει παραπάνω σε αυτό το σημείο γιατί μέσω του παράγοντα σίγμα έχει μεγαλύτερη χημική συγκένεια για αυτές τις αλλοδοχίες. Σε αυτό το σημείο σχηματίζεται αυτό που λέμε ένα κλειστό σύμβλογο. Γιατί ναι μεν η RNA πολυμεράς είναι συνδεδεμένη στο DNA. Το DNA όμως εξακολουθεί να παραμένει δίπλη ελίκα. Στο επόμενο στάδιο το οποίο είναι τυχαίο θα συμβεί σε κάποιες περιπτώσεις αλλά όχι πάντα. Είναι ο σχηματισμός του λεγόμενου ανοιχτού συμπλόγου. Ο ανοιχτός συμπλόγος είναι όταν ξετυπλώνονται οι δύο αλυσίδες του DNA κοντά στην περιοχή μειών 10. Σε αυτό το σημείο το σύμπλογο είναι έτοιμο να ξεκινήσει τη μεταγραφή και αρχίζει να φτιάχνει μικρά RNA αλλά δεν μπορεί να ολοκληρώσει τη μεταγραφή. Γιατί? Ο παράγοντας σήμα, ο οποίος όπως είπαμε είναι υπεύθυνος για την αναγνώριση του υποκινητή, την κρατάει εγκυροβολημένη σε αυτό το σημείο. Μετά από πολλές προσπάθειες, οι λίγες ή περισσότερες, δεν έχει σημασία, αυτό είναι ένα τυχαίο γεγονός, ένα στοχαστικό φαινόμενο, σε κάποια φάση λοιπόν ο παράγοντας σήμα απομακρύνεται, ξεκολλάει. Και τότε και μόνο τότε, η RNA πολυμεράση μπορεί να συνεχίσει την επιμπίκυση του RNA, δηλαδή την μεταγραφή, μέχρι φυσικά να φτάσει στην αλληλουχία λήξης της μεταγραφής όπου θα σταματήσει και θα ξεκολλήσει από το DNA. Επομένως, αν θελήσουμε να το δούμε εδώ, βλέπουμε το εξής, βλέπουμε ότι όταν η RNA πολυμεράση μεταγράφει ένα γωνίδιο, δεν έχει πλέον πέντε υπομονάδες, αλλά έχει μόνο τέσσερις. Ποιες είναι αυτές οι τέσσερις? Οι β-β τόνος α2, δηλαδή β-β τόνος και οι δύο υπομονάδες α. Ο σίγμα έχει ρόλο μόνο για να φέρει την RNA πολυμεράση των βακτηρίων στον υποκινητή. Από εκεί και πέρα πρέπει να φύγει για να ξεκινήσει η μεταγραφή. Εάν δούμε την εφεριοδική RNA πολυμεράση στην άλλη μεριά, την RNA πολυμεράση 2 που, όπως είπαμε, εμπλέκεται στην μεταγραφή των γωνιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, τότε βλέπουμε ότι αυτή η RNA πολυμεράση από μόνη της δεν μπορεί να γνωρίσει τον υποκινητή. Χρειάζεται λοιπόν κάποιες πρωτεΐνες, κάποιους που είναι τελείως απαραίτητες για τη μεταγραφή, γιατί την αυτοδηγούν σε αλλογή ως υποκινητή. Η κύρια πρωτεΐνη είναι ο μεταγραφικός παράγοντας 2D, Tf2D, ο οποίος είναι ένα πόλιπρωτεΐνικό σύμπλοκο, το οποίο αποτελείται από μια μικρή πρωτεΐνη που λέμε Tbp, Tata Binding Protein. Αυτό γιατί, γιατί η καρδιά, το κέντρο του υποκινητή, του ευκαρυωτικού υποκινητή, στο 90% περίπου των περιπτώσεων, είναι μια αλληλουχία Tata, που λέμε κουτί Tata. Λοιπόν, αυτή η αλληλουχία, αυτό κουτί Tata, αναγνωρίζεται από τον Tbp, που είναι Tata Binding Protein, πρωτεΐνη που προσδένεται στο Tata. Πάνω στο Tbp, είναι συνδεδεμένες αρκετές πρωτεΐνης που λέμε Tafs. Taf είναι από το Tbp Associated Factor, δηλαδή παράγοντες οι οποίοι συνδέονται στο Tbp. Όλο αυτό το σύμπλοκο του Tbp με τους Tafs είναι ο μεταγραφικός παράγοντας 2D, ο οποίος αφού συνδεθεί, σε συνεργασία και με το μεταγραφικό παράγοντα TF2B, προσελκύουν την RNA πολυμεράση, την οποία την βλέπετε με RNA πολυμεράση 2 να συνδέεται στον υποκινητή, και αυτό το οποίο φαίνεται είναι ότι η RNA πολυμεράση 2 όταν συνδέεται δεν έρχεται γυμνή, έρχεται σε σύμπλοκο και με κάποιους άλλους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες και αφού σχηματιστεί αυτό το σύμπλοκο, το οποίο είναι κλειστό ακόμα, προσθήθηται και άλλοι μεταγραφικοί παράγοντες όπως ο Tf2e, ο Tf2h κτλ. Αυτό το οποίο δεν φαίνεται σε αυτή την εικόνα είναι και ένα άλλο πολύ σημαντικό πορτενικό σύμπλοκο το οποίο καθοδηγεί την RNA πολυμεράση εδώ, το οποίο το λένε mediator ή διαμεσολαβητή και παίζει πολύ σημαντικό ρόλο. Αλλά αυτό το πούμε στην πορεϊκή βιβλιολογία του χρόνου. Μιλήσαμε για τη μεταγραφή, μιλήσαμε για τα έζημα τα οποία επιτελούν τη μεταγραφή της RNA πολυμεράσης, όμως πως επιτελεί τη μεταγραφική ρύθμιση, πως μπορεί λοιπόν να αποφασίσει η RNA πολυμεράση, πού, πότε και πόσο θα μεταγράψει, πόσο έντονα θα μεταγράψει. Λοιπόν, αυτό που την καθοδηγεί την RNA πολυμεράση είναι η αλληλεπιδράση με κάποιες πρωτεΐνες, με κάποιες ρυθμιστικές πρωτεΐνες, αυτές πρωτεΐνες λέμε ρυθμιστικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Λοιπόν, γιατί, τι ρυθμίζουν τη μεταγραφή, και η ρύθμιση φυσικά δεν είναι μονοθετική, είναι και αρνητική. Σε κάποιες περιπτώσεις μπορεί να έχουμε κάποιους αρνητικούς μεταγραφικούς παράγοντες να μπλοκάρουν την RNA πολυμεράση, απ' το να αναγνωρίσει ένα γονίδιο. Σε κάποιες άλλες περιπτώσεις, ένας θετικός παράγοντας προάγει την μεταγραφή, φέρνει καλύτερα, πιο γρήγορα, πιο έντονα την RNA πολυμεράση σε ένα υποκινητή. Οι πιο πολλοί μεταγραφικοί παράγοντες βρίσκονται να είναι συνδεδεμένοι με το DNA. Κάποιοι από αυτούς αναγνωρίζουν το DNA άμεσα, σε συγκεκριμένες αλληλουχίες. Κάποιοι έμεσα. Πώς έμεσα? Συνδέονται με πρωτέινες, οι οποίες αναγνωρίζουν το DNA. Επίσης, αυτό που πρέπει να καταλάβουμε είναι ότι η σύνδεση των εθνικών παραγόντων με το DNA μπορεί να γίνει είτε κοντά στο σημείο έναρξης της μεταγραφής, είτε μακριά. Στα βακτήρια στους προκαριώντες συνήθως γίνεται κοντά στο σημείο έναρξης της μεταγραφής. Στους ευχαριώντες ισχύει αυτό που είπα προηγουμένως. Μπορεί να γίνεται κοντά, είτε μακριά, είτε μπρος, είτε πίσω, είτε μέσα στο γονίδιο και θα μιλήσουμε για αυτό σε λίγο. Ας δούμε ένα παράδειγμα εδώ. Βλέπουμε για παράδειγμα την βακτυριακή RNA πολυμεράς. Για λόγους απλότητας δεν τη βλέπουμε σαν πέντε πρωτεΐλινες αλλά σαν μία. Βλέπουμε ότι συνδέεται στον υποκινητή που είναι κοντά στο σημείο έναρξης της μεταγραφής. Και μπορούμε να δούμε ότι ένας μεταγραφικός ενεργοποιητής σε αυτή την περίπτωση μπορεί να συνδέεται κοντά στον υποκινητή και έτσι να βοηθάει την RNA πολυμεράση να συνδεθεί στον υποκινητή με μεγαλύτερη συγγένεια. Αν αυτός ο παράγοντας, όπως είπαμε, είναι ένας μεταγραφικός ενεργοποιητής, ένας θετικός παράγοντας. Ενώ αντίθετα βλέπουμε ότι στους ευκαριώτες κάτι τέτοιο μπορεί να συμβεί από μακριά. Βλέπουμε εδώ μια πρωτεΐλινή η οποία συνδέεται κάπου μακριά στον DNA, μακριά από το κουτι τάτα του υποκινητή. Αλλά παρόλα αυτά μπορεί και επικοινωνεί με το σύμπλοκο της RNA πολυμεράσης και το πώς γίνεται αυτή η επικοινωνία είναι πολύ σημαντικό να το καταλάβουμε, γιατί συνήθως έχει να κάνει με λύγισμα του DNA έτσι ώστε απομακρυσμένες περιοχές του DNA να έχουν σε επαφή. Και όπως θα δούμε αργότερα στη Μοριακή Βιολογία, όχι στην Κιταρική, θα δούμε ότι αυτό το λύγισμα δεν είναι τυχαίο αλλά μπορεί να ρυθμίζεται με διαμεσολάβηση άλλων πρωτεϊνών, αρχιδιτωνικών πρωτεϊνών κτλ. Βλέπουμε όμως ότι στα μπακτήρια μπορεί η μεταγραφή να μην ρυθμίζεται μόνο θετικά. Βλέπουμε ότι υπάρχουν οι ειδικές πρωτεΐνες που τους λέμε καταστολείς, οι οποίες μπορεί να συνδεθούν σε ρυθμιστικές περιοχές που συνδυουσίσκονται κοντά στον υποκινητή και επικαλύπτονται με τις θέσεις σύνδεσης της RNA πολυμεράζης βακτηριακής, τις οποίες λέμε χειριστές. Λοιπόν, όταν ένας καταστολέας συνδέεται πάνω στο χειριστή, τότε στην πράξη δεν μπορεί, αποτρέπει την RNA πολυμεράζη από το να συνδεθεί στον υποκινητή. Γιατί δεν φράζει τον δρόμο. Το κλασικό παράδειγμα είναι το παράδειγμα του περαιονίου της λακτόζης. Όπου βλέπουμε ότι όταν ακύτερα δεν έχουν λακτόζη, που είναι ένα τσάχαρο, τότε ο καταστολέας μπλοκάρει την RNA πολυμεράζη και αυτή δεν μπορεί να μεταγράψει τρία γωνίδια ενός περαιονίου, του περαιονίου της λακτόζης, τα οποία μπλέκονται στον καταβολισμό του τσάχαρου. Αυτό δεν είναι λογικό για λόγους οικονομίας. Για μεταγραφή πρέπει να καταλάβουμε ότι είναι καταναλώση ενέργειας, καταναλώση θρηφωσφορικών ρίβων νικλωτιδίων. Άρα δεν υπάρχει λόγος να γίνει αν δεν υπάρχει μια ανάγκη. Επομένως, αν το μπακτήριο δεν έχει λακτόζη την οποία χρειάζεται να την καταναλώσει για να παράγει περισσότερη ενέργεια, θα ήταν μπλακώδες για αυτό εδώ. Να καταναλώσει ενέργεια για να φτιάξει πρωτεγίνες που δεν χρειάζεται. Όταν, όμως, υπάρχει λακτόζη στο περιβάλλον, τότε τι βλέπουμε να γίνεται. Βλέπουμε ότι αυτό το σοδιτζαχαρίτις συνδέεται πάνω στο μόριο του καταστολέα. Μετά τη σύνδεση, ο καταστολέας αλλάζει δομή και δεν μπορεί πλέον να συνδεθεί με το DNA του χειριστή. Επομένως, ο υποκινητής πλέον είναι ελεύθερος, δεν υπάρχει κανένα εμπόδιο για την αραινή πολυμεράση, να συνδεθεί πάνω του και να ξεκινήσει την μεταγραφή των γονιδίων του οπερωνίου της λακτόζης. Εδώ, όπως είδαμε και πάλι και προηγουμένως, βλέπουμε ότι υπάρχουν κάποιες αλληλουχίες απομακρυσμένες, που τις λέμε ενισχυτές, στις οποίες μπορεί να συνδεθούν, εδώ βλέπουμε μόνο ένα πρωτεϊνικό παράγοντας, συνήθως είναι αρκετοί πρωτεϊνικοί παράγοντες, αρκετές πρωτεΐνες, οι οποίες από απόσταση θα επικοινωνήσουν με το σύμπλοκο της RNA πολυμεράσης, είτε άμεσα με την RNA πολυμεράση, είτε με τον διαμεσολαβητή με τον οποίο μιλήσαμε, είτε με κάποιους άλλους μεταγραφικούς παράγοντες και στη συνεργασία και με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες που μπορεί να συνδέονται και πιο κοντά στον υποκινητή, οι μεταγραφικοί παράγοντες του ενισχυτή μπορούν να ρυθμίσουν την έκφραση του γονδίου στοχου. Πώς μπορούμε να το αποδείξουμε αυτό. Βλέπουμε ότι αν με θόση ομοριακής βιολογίας πάρουμε μια αλληλουχία ενός ενισχυτή και την βάλουμε μπροστά σε ένα γονίδιο, το οποίο εκφράζει σε ένα x βαθμό, θα δούμε ότι η μεταγραφή αυτού του γονιδίου στοχου πλέον θα αυξηθεί κατά εκατόχη παραπάνω. Ένα πολύ ενδιαφέρον σε ιδιότητε των ενισχυτών είναι ότι δεν έχει σημασία αν βρίσκονται κοντά ή μακριά από τον υποκινητή ή αν βρίσκονται πριν από την μεταγραφική μονάδα ή μετά το τέλος της μεταγραφικής μονάδας ή ακόμα ακόμα και μέσα ένα ιδρόνια. Όπου και να το βάλουμε θα προκαλέσει ενεργοποίηση της μεταγραφής και όχι μόνο αυτό εδώ. Η φορά της αλληλουχίας επίσης δεν έχει κανένα σημασία. Δηλαδή, αν αυτή την αλληλουχία την εισάγουμε είτε με πρόστια φορά είτε με την αντίθετη θα έχουμε ακριβώς το ίδιο ιδιολογικό αποτέλεσμα, δηλαδή η ενεργοποίηση της μεταγραφής. Παρόμοιες αλληλουχίες που έχουν όμως το αντίθετο αποτέλεσμα, δηλαδή όταν τις βάλουμε κοντά ή μακριά μπρος ή πίσω ή μέσω γωνίδια, καταστέλουν, σταματούν την γωνιδιακή έκφραση, λέγονται αποσιωπητές, silencers, αγγλιστή και ο τρόπος με τον οποίο δεν πετύχει είναι ακριβώς ο ίδιος, δηλαδή προσελκύουν κάποιους μεταγραφικούς παράγοντες, ρυθμιστικούς μεταγραφικούς παράγοντες, οι οποίοι όμως αντί να προάγουν η μεταγραφή, όπως την περίπτωση των ενισχυτών, όταν έχουν την αποσιωπητή προκαλούν καταστολή της μεταγραφής. Άρα βλέπουμε ότι ανάλογα από το ίδιος των πρωθυνικών παραγόντων, των ρυθμιστικών μεταγραφικών παραγόντων, που τα συνδεδούν στο DNA, θα έχουμε διαφορετικές επιδράσεις, είτε θετικές ή θετικές, πάνω στα επίπεδα της μεταγραφής συγκεκριμένων γονιδίων. Δεν θα πρέπει όμως ποτέ να ξεχνάμε ότι το υπόστρωμα της μεταγραφής, δηλαδή η μήτρα, είναι με DNA, αλλά το DNA δεν είναι γυμνό, όπως είπαμε, είναι σε μορφή χρωματήρης. Εδώ βλέπουμε μια ευκαρειοτική περιοχή χρωματήρης, η οποία αποτελείται από νουκλαιοσώματα. Αυτά τα νουκλαιοσώματα μπορεί μέσα τους να θάβουν, να κρύβουν κάποιες αλληλουχίες DNA. Και αυτές οι αλληλουχίες μπορεί να είναι αλληλουχίες που αναγνωρίζονται από κάποιους θετικούς ή αλληλουχικούς μεταγραφικούς παράγοντες, δεν έχει σημασία. Εάν παραμείνουν θαμένες, τότε ο μεταγραφικός παράγοντες δεν μπορεί να τις αναγνωρίσει, άρα δεν μπορεί να έχει καμία επίδραση. Επομένως, εάν με οποιοδήποτε τρόπο υπάρχουν τέτοιοι τρόποι, ένα νουκλαιοσώμα μετεκίνηθεί λίγο αριστερά, η δεξιά, ή αν χαλαρώσει το DNA, έτσι ώστε να αποκαλυφθεί αυτή η αλληλουχία, τότε μπορεί ο μεταγραφικός παράγοντες να συνδεθεί πάνω της και να αρχίσει μια ολόκληρη αλληλουχία γεγονότων, η οποία να οδηγήσει στη μεταγραφή ενός γονιδίου στόχου. Πώς μπορεί να γίνει αυτό διχημικά? Αυτό μπορεί να επιτεχθεί με διάφορες μεταμεταφραστικές τροποποίησεις των ισθωνών, οι οποίες βρίσκονται στα νουκλαιοσωμάτια. Συγκεκριμένα, τα άκρα των ισθωνών και συγκεκριμένα τα άμυνοτελικά τους άκρα, επειδή δεν είναι θαμένα μέσα στο νουκλαιοσώμα, αλλά προεκβάλλουν προς τα έξω, αποτελούν στόχους για ένζυμα, όπως αυτά τα οποία μπορούν τις ακυτηλάσεις των ισθωνών, που μπορούν να τα ακυτηλιώσουν. Η ακυτηλίωση των ισθωνών μπορεί να πετύχει δύο διακριτούς στόχους. Ο ένας είναι να χαλαρώσει λίγο την τομή του νουκλαιοσώματος και ο δεύτερος είναι να προσελκύσει μια ομάδα μεταγραφικών παραγόντων, αυτά που περιέχουν μια συγκεκριμένη επικράτεια που τη λέμε μπρόμο επικράτεια, οι οποίες θα προάγουν έμεσα ή άμεσα την μεταγραφή. Αντίθετα, τα μηνοτελικά άκρα των ισθωνών μπορούν να υποστούν κάποιες άλλες τροποποίησεις, όπως οι μεθυλιώσεις από μεθυλάσσες των ισθωνών. Επομένως, σε αυτή την περίπτωση όμως, δεν έχουμε ενεργοποίηση με μεταγράφικες, αλλά έχουμε καταστολή. Γιατί οι μεθυλιωμένες ισθώνες αναγνωρίζονται από μια άλλη τάξη πρωτεϊνών, από μια κοινή επικράτεια, την χρώμο επικράτεια, η οποία συνήθως οδηγεί σε σχηματισμό συμπαγούς χωματίνης, η οποία ουσιαστικά θα οδηγήσει και σε καταστολή της έκφρασης. Άρα τι βλέπουμε εδώ, βλέπουμε ότι η χωματίνη είναι κάτι δυναμικό και ότι οι χημικές διδράσεις που θα συμβούν πάνω στις ισθώνες μπορούν να επηρέασουν διδομή της χωματίνης και είτε να διευκολύνουν τη μεταγραφή, είτε να την καταστήλουν. Αλλά η μεταγραφή μπορεί να επηρεαστεί όχι από τροποποιήσιμόν των ισθωνών, αλλά από τροποποίησης και του ίδιου του DNA. Βλέπουμε για παράδειγμα ότι υπάρχουν αρκετές περιπτώσεις, όπου κάποια γονίδια μπορούν να υπόκεινται σε κληρονομίσιμη απενεργοποίηση γονιδιακής έκφρασης. Δηλαδή, το γονίδιο age 19, παρά το ότι θα το πάρουμε και από το μπαμπά και την μαμά, αυτό που βλέπουμε είναι ότι δεν εκφράζεται από το πατρικό αλληλόμορφο, αλλά μόνο από το μηδρικό. Γιατί το πατρικό DNA είναι μεθυλιωμένο και στα σημεία που είναι μεθυλιωμένο, έχει δομηθεί συμπαγή σε τεροχρωματίνη, η οποία ουσιαστικά δεν αφήνει την RNA πολυμεράση να το μεταγράψει. Και βλέπουμε ότι ακόμα και μετά την αντιγραφή του πατρικού DNA, η μεθυλίωση παραμένει, γιατί ακόμα και μετά την αντιγραφή μία από τις δύο αλυσίδες του DNA είναι μεθυλιωμένοι και μπορεί να προσελκύσει ένζιμα τα οποία μεθυλιώνουν και την απέναντι αλυσίδα. Βλέπουμε ότι και οι τροποποιήσεις του DNA μπορεί να οδηγήσουν σε ρύθμιση της γοντιακής έκφρασης, κυρίως βέβαια η μεθυλίωση οδηγεί σε καταστολή της γοντιακής έκφρασης, γιατί προσελκύει μια σειρά προυτεϊνών που διευκολύνουν το σχηματισμό συμπαγούς, υπερβολικά σπιρωμένης, ετεροχρωματίνης. Λοιπόν, και μετά τη μεταγραφή τι γίνεται. Μετά τη μεταγραφή, αν πάρουμε ένα βακτήριο θα δούμε ότι το προϊόν της μεταγραφής είναι ήδη ένα αγγελιοφόρο RNA, το οποίο θα αρχίσει να μεταφράζεται πριν ακόμα τελειώσει η μεταγραφή. Αυτό όμως δεν συμβαίνει στους ευχαριώτες. Όμως είδαμε και προηγουμένως στους ευχαριώτες, η μεταγραφή η οποία γίνεται στον πυρήνα δεν παράγει αγγελιοφόρο RNA. Παράγει ένα πρόγρομο μόριο, το οποίο τα λέμε πρωτογενές μετάγραφο, το οποίο θα πρέπει να οριμάσει, γιατί περιέχει αλληλουχίες εξωνίων και διτρονίων, ανάκατα τη μία με την άλλη. Λοιπόν, επομένως δεν μπορεί να μεταφραστεί και πρέπει να γίνουν κάποιες αλλαγές, όπως είπαμε, όπως η απομάκρυση των νιτρονίων, η ένωση των εξωνίων, αλλά και κάποιες άλλες αλλαγές. Ποιες είναι οι άλλες αλλαγές? Αλλαγές γίνονται και στην αρχή αυτόν τον πρόγρομο μόριον, στο πέντε άγρο τους και στο τέλος, στο τρία άγρο τους. Βλέπουμε, λοιπόν, ότι στο πέντε άγρο του πρόγρομου mRNA, γίνονται κάποιες τροποποίησεις. Έρχεται και προσθήθεται ένα τροποποιημένο νυκλοεπίδιο, μια εφτά μεθυλογουανοσύνη, την οποία τη λέμε καλύπτρα. Αλλά αυτό που βλέπουμε είναι και οι επόμενες δύο βάσεις του mRNA μεθυλιώνονται. Είναι σημαντικό αυτό? Αυτό είναι εξαιρετικά σημαντικό, γιατί όπως θα δούμε και αργότερα, λίγα αργότερα σήμερα, πάνω σε αυτήν την καλύπτρα είναι πολύ σημαντική και για την μακροβιώτητα του mRNA, για τη σταθερότητά του, γιατί προσελκύει συγκεκριμένες πρωτεΐνες, αλλά και για την μεταφρασιμότητά του, δηλαδή την ικανότητά του, να προσελκύσει ή να αναγνωριστεί από την μικρή υπομονάδα του ριβοσοματίου, η οποία θα έρθει μαζί με ευκαιριωτικούς παράγοντες έναρξης της μεταφράσης, να συνδεχθεί πάνω του και κατόπιν μετά από ορισμένα άλλα στάδια να ξεκινήσει τη μεταφράση. Άρα λοιπόν, στο πέντε άκρο, το πρόδρομο mRNA υφίσαται προσθήκη της καλύπτρας. Τι κείται στο μέσο? Στο μέσο, όπως είπαμε, ένα εφεριοδικό mRNA έχει τα εξόνια, τα οποία είναι αυτά τα οποία περιέχουν τα τύματα τα οποία κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες, αλλά όχι μόνο, οι προμοτιέχουν και αμετάφραστηματα, και τα ιντρόνια τα οποία θα πρέπει να απομακρυαθούν. Αυτό που βλέπουμε είναι ότι μέσα στον πυρήνα υπάρχουν ειδικά μικρά ρίβο νουκλοπρωτενικά συμπλοκά, τα οποία αποτελούνται από RNA και πρωτεΐνες, τα οποία αναγνωρίζουν θέσεις οι οποίοι σκαθορίζουν τα όρια των ιντρονία. Και κατόπιν φαίνοντάς τα κοντά του ένα μετά άλλο και προάγοντας την ένωση των εξωνίων μεταξύ τους και το σχηματισμό μιας σαλιγκοϊδούς δομής στο ιντρόνιο που τη λέμε Lariat, βοηθούν ουσιαστικά στην απομάκρυση των ιντρονίων και στην ένωση των εξωνίων. Σε αυτήν τη διαφάνεια βλέπουμε αυτό φαινόμενο να γίνεται μία φορά, στην πράξη όμως τα πιο πολλά γονίδια περιέχουν πολύ περισσότερα από ένα ιντρόνια, άρα αυτή η διαδικασία θα πρέπει να επαναληθεί με ακρίβεια πάρα πάρα πολλές φορές. Αλλά όχι μόνο αυτό. Τα πιο πολλά πρόγομα πρωτογενή μετάγραφα, ανάλογα με τον τύπο του κιτάρου στον οποίο εκφράζονται, μπορεί να υποστούν αυτό που λέμε εναλλακτικό μάτισμα, δηλαδή να οριμάσουμε διαφορετικό τρόπο, έτσι ώστε για παράδειγμα ένα ιντρόνιο, το οποίο θα απομακρυνθεί σε ένα τύπο κιτάρου σε μια συγκεκριμένη φορική στιγμή, σε μία άλλη μπορεί να παίξει τον ρόδο εξωνίο. Ή κάποια άλλα εξώνια, τα οποία υπάρχουν σε ορισμένα MRNA, να απομακρυνθούν με μάτισμα σε κάποιους άλλους τύπους κιτάρων. Λοιπόν, αυτή η εναλλακτική σειραφή των MRNA, αυτό το εναλλακτικό μάτισμα, μπορεί να οδηγήσει στη σύνθεση πρωτεϊνών με διαφορετικές ιδιότητες και το βλέπουμε πάρα πολύ συχνά και φυσικά αυτό εδώ καθορίζεται από αλληλεπίδραση με διαφορετικές πρωτεΐνες. Τέλος, ας κοιτάξουμε τα τρία τόνος άκρα των MRNA στο τέλος τους και να δούμε τι συμβαίνει εκεί. Αυτό που βλέπουμε είναι ότι υπάρχουν πάντα συγκεκριμένες αλληλεγχίες και στα τρία άκρα τους. Λοιπόν, άρα, μετά το τέλος σκοτικής περιοχής ενός ή δύο, το μήκος του τρία άκρου μπορεί να διαφέρει, μπορεί να είναι μικρό, μεγάλο ή μεγαλύτερο. Αλλά πάντα αυτό που βλέπουμε είναι ότι υπάρχει μια αλληλουχία κάπου προς το τέλος. AAT, AAA, αυτή είναι απόλυτα στριμμένη. Λίγο μετά από αυτή είναι μια αλληλουχία πολύ μικρή, δύο νεκροδίδια CA. Και αυτό ακολουθείται από μια αλληλουχία η οποία είναι πλούσια σε GKU, στο οποίο θα τερματίσει η RNA η πολυμεράση. Μετά όμως από τον τερματισμό, αυτό το οποίο συμβαίνει είναι πρώτα μια αποκοπή από ένα νουκλιάστισμα στο CA και σε εκείνο το σημείο έρχεται ένα άλλο ενισμό το οποίο δεν είναι RNA η πολυμεράση, το λέμε Πολυαία η πολυμεράση, το οποίο προσθέτει μια Πολυαία ουρά. Δηλαδή μια ουρά Πολυαρνηλικών. Συνήθως ο μέσος όρος μήκους αυτής της ουράς στους ευχαριώτες είναι γύρω στα 200 αδεμιλικά. Εδώ να πούμε ότι τα προκαριοτικά mRNA δεν έχουν τέτοια Πολυαία ουρά. Γιατί χρειάζεται αυτή η Πολυαία ουρά θα δούμε ότι είναι εξαιρετικά σημαντική για τη σταθερότητα του mRNA. Και εδώ βλέπουμε τα σήματα τα οποία υπάρχουν για την Πολυαία δημιούργηση και βλέπουμε ότι η αλληλουχία AAUAAA είναι εξαιρετικά συντηρημένη σε όλα τα αγωνίδια. Γιατί χρειάζονται οι Πολυαίοι ουρές. Ένας από τους λόγους είναι ο εξής. Πάνω στην Πολυαία ουρά συνδέονται πάρα πολλές πρωτεΐνες προσδένονται στο Πολυαίοι. Αυτές οι πρωτεΐνες παρεμποδίζουν την είσοδο έξω νουκλαιασών οι οποίες μπορούν να έρθουν και να απομακρύνουν, να αποκοδομήσουν το mRNA από το τρία άγρο σε κατεύθυνση δηλαδή τρία προς πέντε και να το αποστεθερωπίσουν. Μάλιστα, οι πρωτεΐνες αυτές αλληπιδρούν με άλλες πρωτεΐνες που συνδέονται στην καλύπτρα και στην πράξη φαίνεται σαν να είναι το mRNA κυκλικό όταν μεταφράζεται. Με αυτόν τον τρόπο κρύβονται τα πέντε τόνους και τα τρία τόνος άγρα τα οποία μπορούν να αποτελέσουν όπως είπαμε τους τόγους. Είτε των τρία τόνος προς πέντε εξωνουκλαιασών που κινούνται με κατέθυση από τρία τόνος προς πέντε τόνος ή άλλων εξωνουκλαιασών ξεκινώντας από το πέντε άγρο και με κατέθυση πέντε προς τρία μπορούν να αποκοδομήσουν το mRNA από την αρχή του, την άλλη μεριά. Βλέπουμε ότι το μήκος της πολυεϊουράς όπως ήταν γνωστό, η ίδια την δεκαετία του 70 πολλές φορές μπορεί να επηρεάσει θετικά δυσταθερότητα ενός mRNA. Κλείνοντας, θα ήθελα να πω το εξής μέχρι τώρα μιλήσαμε πάρα πολύ για τα προϊόντα της μεταγραφής τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες, τα mRNA. Απλά να καταλάβουμε λιγάκι ότι και τα μετάγραφα, δηλαδή προϊόντας μεταγραφής από RNA πολυμεράση 1, δηλαδή τα ριβασονικά RNA, και τα προϊόντα μεταγραφής της RNA πολυμεράσης 3, δηλαδή κυρίως το tfRNA, και αυτά όταν συνήθενται δεν είναι πλήρως όρημα. Και αυτά εδώ λοιπόν φτιάχνουν σαν πρόδρομα μόρια τα οποία κατόπιν μια διαδικασία πολλαπλών εκτομών, πολλές εκ των οποίων βασίζονται σε RNA ένζυμα, οριμάζουν σε όριμα ριβασονικά RNA, 28S, 28S, 5,8S, ή σε όριμα tfRNA. Απλά εδώ να σας πω ότι η ριβονοκλαάση P, η οποία εμπλέκεται στην ορίμαση των tfRNA, ήταν ένα από τα πρώτα ριβοένζυμα τα οποία ανακαλύθηκαν, και συγκεκριμένα ανακαλύθηκε ότι η RNA υπομονάδα της στα βακτήρια, ήταν αυτή εδώ η πρωτεΐνη C5, το RNA μη1, το οποίο σε συνεργασία με την πρωτεΐνη C5 μπορούσε να αποκόψει αυτό το tfRNA. Και εδώ θα κλείσουμε το κεφάλαιο της μεταγραφής και θα ήθελα να σας ευχαριστήσω για άλλη μια φορά για την προσοχή σας.