Μηχανήματα Λειτουργικής Γονιδιωματικής (1) / Διάλεξη 22 / Λειτουργική Γονιδιωματική - Εισαγωγή, Μηχανήματα αλληλούχισης πρώτης γενιάς, Μηχανήματα αλληλούχισης δεύτερης γενιάς, Μηχανήματα αλληλούχισης τρίτης γενιάς, Σύγκριση Μηχανημάτων αλληλούχισης, Συστοιχίες DNA, Φασματογράφος μαζών - Τριανταφυλλίδης Αλέξανδρος (ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ, 2014)
Λειτουργική Γονιδιωματική - Εισαγωγή, Μηχανήματα αλληλούχισης πρώτης γενιάς, Μηχανήματα αλληλούχισης δεύτερης γενιάς, Μηχανήματα αλληλούχισης τρίτης γενιάς, Σύγκριση Μηχανημάτων αλληλούχισης, Συστοιχίες DNA, Φασματογράφος μαζών: Καλημέρα. Σήμερα θα συνεχίσουμε με το κομμάτι αυτό καθαυτό της αλληλούχησης, το next generation sequencing. Ζητήσαμε στο προηγούμενο μάθημα και προσπαθήσαμε να θυμηθούμε κάποια πράγματα σχετικά με το κλασικό sequencing που γινόταν στα μηχανήματα TBI. Είδαμε ακριβώς ποια είναι η βασική διαδικασία για να κάνεις sequencing κατά σάγγερ και σήμερα θα ασχοληθούμε με τα μηχανήματα 2ης γενιάς, 3ης γενιάς και το καθεξής. Ξεκινάμε από το βασικό δεδομένο ότι αυτά τα μηχανήματα έχουν πραγματικά τρομερή ανάπτυξη τα τελευταία χρόνια. Το πρώτο μηχάνημα βγήκε περίπου το 2005 και θα το συνεχίσουμε αναλυτικά. Και από εκεί και πέρα σκεφτείτε ότι μέσα σε λιγότερο από 10 χρόνια έχουν βγει τουλάχιστον πάνω από 6.000 εργασίες οι οποίες χρησιμοποιούν το NGS, δηλαδή το next generation sequencing. Γι' αυτό είναι και αυτό που σας λέω ότι έχει μπει κανονικότατα σε εφαρμογή και σε παραγωγή αποτελεσμάτων. Γι' αυτό θεωρώ ότι οποιοσδήποτε βιολόγος γενετιστής, μωριακός βιολόγος στο μέλλον θέλει να δουλέψει σε αυτό το πεδίο είναι σχεδόν δεδομένο ότι θα χρησιμοποιεί NGS. Και βεβαίως θα χρειαστεί να χρησιμοποιείς και βιοπληροφορική για να μπορέσεις να αναλύσεις αυτά τα δεδομένα. Κάνουμε ένα μικρό flashback και ταυτόχρονα μια σύνδεση. Πάμε πίσω 4-5 χρόνια για να συγκρίνουμε το τι γινόταν ακόμα πιο πολύ στο παρελθόν και τι γινόταν πέρα από 4-5 χρόνια και κάποια στιγμή θα φτάσουμε και στο παρόν. Έτσι λοιπόν, αυτή είναι μια διαφάνεια που είχα πέρα από περίπου 4 χρόνια στο αντίστοιχο μάθημα που έκανα στους φοιτητές ότι ενώ ας πούμε το 1987 μπορούσαμε να παράγουμε με ένα μηχάνημα Applied Biotechnology 4.800 βάσεις την ημέρα το πολύ, το 2010 παράγαμε 25 δισεκατομμύρια βάσεις και το κόστος περίπου για να μπορέσουμε να παράγουμε τέτοιες δεδομένα ενός ανθρώπινου γονιδιώματος ήταν, είχε πέσει πια αρκετά από τα 3 δισεκατομμύρια πριν από 10 χρόνια σε περισσότερο από 10.000 δολάρια. Εκείνη την εποχή για να έχουμε έναν ανθρώπινο γονιδιώμα χρειαζόμαστε περίπου μια εβδομάδα και όλα ξεκίνησαν όμως από το 2005 και μετά. Το 2005 ήταν η πρώτη εργασία που βγήκε στο Nature η οποία παρουσίαζε για πρώτη φορά στην επιστημονική κοινότητα το μηχάνημα το 454. Το μηχάνημα αυτό ήταν ένα Massively Parallel Machine. Το λέει εδώ πέρα και τι σημαίνει Massively Parallel Machine. Είχε μεγάλο πλεονέκτημα και θα δούμε και βιντεάκια για διάφορα μηχανήματα Next Generation Sequencing. Είχε το πλεονέκτημα ότι δεν είχαμε 1, 2, 3, 386 ας πούμε τριχοειδείς τα οποία μπορούσαμε να κάνουμε το sequencing αλλά είχαμε ταυτόχρονα εκατομμύρια αντιδραστήρες πάνω στο οποίο γίνονταν το sequencing. Έτσι λοιπόν είχαμε τη δυνατότητα και θα το δούμε και πιο αναλυτικά να έχουμε τη δυνατότητα να πάρουμε την αλληλουχία ενός μικρού γονιδιώματος όπως το μηχάνημα μέσα σε 4 ώρες με πολύ υψηλή ακρίβεια, ήδη από τότε τα μηχανήματα αυτά ήταν αρκετά ως και πολύ ακριβή ενώ μπορούσαμε για πρώτη φορά να πάρουμε την αλληλουχία του ανθρώπου, το 2005 παραλαμβάνω αυτό, μέσα σε μερικές μέρες. Θα δούμε διάφορα βιντεάκια σήμερα προσπαθώντας να πάρουμε μια ιδέα για το πως δουλεύουν αυτά τα μηχανήματα χωρίς να με ενδιαφέρει για σας να ξέρετε πως δουλεύουν αυτά τα μηχανήματα. Θα βασιλήσω μόνο βασικές βασικές αρχές. Αυτό το βιντάκι δεν έχει ήχο, έχει μια μουσική όλο και όλο. Υπάρχουν αντίστοιχα εναφορές και μέσα στις διαφάνειες για το ποιο είναι. Προχωρήσουμε λίγο πιο πριν. Ξεκινάει λοιπόν από το γεγονός ότι αυτό που χρειάζεται είναι παίρνουμε το DNA και το DNA το σπάζουμε σε μικρά κομμάτια. Όπως έχουμε πει και πολλές φορές το shotgun sequencing χρειάζεται να σπάσει το DNA σε πολλά μικρά κομμάτια. Και αυτό που χρειάζεται σε πάρα πολλές τέτοιες περιπτώσεις είναι αντάπτορες που θα τους δούμε και πάρα πολλές φορές και σε άλλα μηχανήματα να χρησιμοποιούνται, οι οποίοι κολλάνε αριστερά και δεξιά από τις αλληλουχίες οι οποίες μας ενδιαφέρουν. Το σημαντικό σε όλες αυτές τις περιπτώσεις είναι γιατί τους χρειαζόμαστε αυτούς τους αντάπτορες. Γιατί σκεφτείτε ότι μιλάμε για άπειρες αλληλουχίες μικρά μεγέθη γιατί επίσης δεν έχουμε καμία γνώση της αλληλουχίας. Οπότε για να μπορεί να έρθει οποιαδήποτε πολυμεράση να δουλέψει επάνω σε αυτή την αλληλουχία και να μπορέσει να συνθέσει το θυκατρικό κλώνο από κάπου πρέπει να ξεκινήσει. Εφόσον είναι άγνωστη αλληλουχία δεν μπορεί να ξεκινήσει από κάποια γνωστή αλληλουχία, οπότε χρειαζόμαστε τους αντάπτορες πάνω στους οποίους θα μπορέσουν να δουλέψουν οι εγκινητές για να ξεκινήσει να δουλεύει και η πολυμεράση και να συνθέσει το θυκατρικό κλώνο. Το μεγάλο χαρακτηριστικό αυτού του μηχανήματος αυτό το οποίο δουλεύει είναι με το λεγόμενο emulsion PCR. Emulsion είναι το γαλάκτομα και έχει την έννοια του εξής. Ξεκινάει όλη η διαδικασία ως εξής. Παίρνεις λοιπόν τα διαφορετικά σου τα κομματάκια τα οποία σπάζουν μικρά μικρά και έχεις τους αντάπτορες. Βάζεις και τους αντάπτορες. Από κει και πέρα αυτό που χρειάζεται είναι βλέπετε αυτά τα σφαιρίδια που αυτά τα σφαιρίδια πάει και κολλάει ένα μόριο DNA σε ένα τέτοιο σφαιρίδιο. Και με αυτόν τον τρόπο έχουμε δημιουργήσει την αρχική μας ποσότητα DNA η οποία θα πάει από κει και πέρα για PCR. Πώς θα γίνει αυτό το PCR θα γίνει μέσα σε γαλάκτομα. Έτσι λοιπόν όλα αυτά τα σφαιρίδια τα beads θα μιχθούν και μέσα σε κατάλληλο γαλάκτομα μέσα σε κατάλληλες σταγόνες όπου μέσα σε αυτές τις αγώνα υποθετικά σε κάθε σταγόνα γαλακτόματος θα υπάρχει ένα τέτοιο σφαιρίδιο. Σε αυτό το σφαιρίδιο επίσης αυτές τις αγώνες θα υπάρχουν και όλα τα απαραίτητα υλικά για να μπορέσει να ενισχυθεί το PCR μας. Έτσι λοιπόν θα ενισχυθεί ο κλώνος ο αρχικός, θα πάει ο ίδιος ο κλώνος μέσα σε αυτό το σφαιρίδιο να πάει να κολλήσει σε μια άλλη θέση του ίδιου σφαιριδίου και θα γίνει ένα συνεχές επαναλαμβανόμενο PCR οπότε τελικά από το ένα σφαιρίδιο με ένα μόριο DNA θα έχουμε ένα σφαιρίδιο με πάρα πολλά αντίγραφα αυτού του μωρίου DNA. Και όταν τελειώσει αυτό το emulsion PCR θα έχουμε τη δυνατότητα να πάρουμε ένα σφαιρίδιο μέσα στο γαλάκτομα που έχουμε εκατοντάδες αντίγραφα αυτού του αρχικού του κομματιού του DNA που μας ενδιέφερε. Και από εκεί και πέρα έρχεται η ώρα του sequencing. Βάζουμε αυτά τα σφαιρίδια μέσα σε κατάλληλους πόρους όπου σε κάθε πόρο υπάρχει και διαφορετικό σφαιρίδιο. Και από εκεί και πέρα αυτό που χρειάζεται να κάνουμε είναι πετάμε τον δεύτερο κλόνο, τον θυγατρικό κλόνο και αρχίζουμε και κάνουμε σύνθεση του θυγατρικού κλόνου μέσα πια στο μηχανήμα μας το 454. Έτσι λοιπόν με μια τεχνική η οποία λέγεται pyro sequencing που δεν μας ενδιεφέρει αυτή τη στιγμή ιδιαίτερα πώς γίνεται πάντως βασίζεται στην εκπομπή φωτός μέσα από λισουφεράση. Κάθε φορά που συνθέτεται περνάνε τα νοικλοτήρια για να στενθούν βλέπετε εδώ πέρα παίρνουμε διαφορετικά χρωματάκια. Και τα χρωματάκια αυτά είναι στα 1,6 εκατομμύρια αντιδραστήρες η οποία ακριβώς σε κάθε διαφορετικό σήμα που έχουμε ενσωμάτωση συγκεκριμένου νοικλοτηδίου παίρνουμε και το σήμα ότι έχουμε αντίδραση. Και βλέπετε εδώ πέρα ακριβώς το σήμα βλέπετε εδώ πέρα κάπου έχουμε πιο ψηλές κορυφές, κάπου πιο χαμηλές κορυφές, η ψηλή κορυφή σημαίνει ότι έχουμε προσθέσει πολλά νοικλοτήδια από το ίδιο νοικλοτήδιο. Και έτσι λοιπόν παίρνουμε εκατομμύρια αποτελέσματα από κάθε διαφορετική θέση και με αυτόν τον τρόπο παίρνουμε το αποτέλεσμα. Το καταλάβατε περίπου πως γίνεται. Έτσι λοιπόν το βλέπετε με βάση από την εργασία η οποία δημιουργήθηκε, το DNA σπάζ, μπαίνουν οι αντάπτορες, από κει και πέρα γίνεται το emulsion PCR, μετά κάθε σφαιρίδιο με μονόκλωνο πια DNA που έχει αντιγραφή μπαίνει στη διαφορετική θέση και εδώ πέρα πια γίνεται η σύνθεση και βλέπετε εδώ πέρα το emulsion, το γαλάκτομα. Και κάθε φορά αυτό που χρειάζεται είναι, ξεκινάμε έρχεται από εδώ πέρα από το μηχάνημα, περνάει το νοικλοτήδιο, εφόσον πει νοικλοτήδιο συγκεκριμένο έχουμε φως. Άμα δεν πει νοικλοτήδιο, δεν προσθεθεί νοικλοτήδιο, τότε δεν παίρνουμε φως. Σε κάθε διαφορετική κεφαλίδα. Εδώ είναι όλη η αδικασία γραμμένη, με κάθε προσθήκη ενός νοικλοτήδιου υπάρχουν φωτοευαίσθητες ευαισθητήρες που διαβάζουν νοικλοτήδιο σε ένα από τους 1,6 εκατομμύρων διδραστήρες. Έτσι λοιπόν, όταν βγήκε το 2005 αυτή η τεχνική ήταν εντελώς επαναστατική. Είχε τη δυνατότητα να διαβάζει τις αλληλουχίες αυτές, βέβαια ακόμα υπήρχαν προβλήματα. Από τότε η χημεία των αντιδράσεων και όλα αυτά τα διαφορετικά υλικά που χρησιμοποιήθηκαν αναπτύχθηκαν. Άρα λοιπόν αυτή ήταν η κατάσταση τότε και σιγά σιγά όλα αυτά τα μηχανήματα μας έδιναν και καλύτερα αποτελέσματα. Τότε μπορούσαμε να διαβάσουμε κομμάτια όταν ξεκινήσαμε με 100 βάσεις, πολύ λιγότερο από τα 500-600 κομμάτια μπορούσαμε να διαβάσουμε σε ένα IBI μηχάνημα. Δεν είχαμε βέβαια και τόσο καλή επαναληψημότητα, τόσο καλή ακρίβεια. Δεν ήταν πλήρως αυτοματοποιημένα, αλλά αυτό ήταν το 2005. Από τότε πολλά αλλάξανε και στη διάρκεια αυτόν τον διαφανειό θα βλέπετε διάφορες εργασίες τις οποίες θα σας βάλω και στο Moodle που λέει ακριβώς ποιά είναι η κατάσταση του sequencing το 2007, το 2010, το 2014. Είναι αυτό που σας είπα, ότι μέχρι να μάθεις πως δουλεύει το ένα το μηχάνημα έχει βγει και ένα καινούργιο μηχάνημα. Από τότε εκείνη την εποχή και όλα αυτά τα χρόνια βγήκαν τρία-τέσσερα βασικά μηχανήματα. Το ένα το μηχάνημα το 454 το pyro sequencing, το οποίο όπως βλέπετε μπορούσε να έχει και συγκρίνεται λίγο με τα μηχανήματα τα IBI, που το ένα μηχάνημα IBI το περισσότερο που μπορούσε να κάνει ταυτόχρονα ήταν 386 αντιδράσεις. Εδώ μιλάμε ταυτόχρονα γίνονται 1 με 2 εκατομμύρια αντιδράσεις ταυτόχρονα. Και το μέγεθος των κομματιών που πια μπορούσαμε να πάρουμε εύκολα με ένα 454 μηχάνημα προσωμιάζει τα μηχανήματα τα IBI, μπορούσαμε να πάρουμε ένα μέσο μέγεθος τμήματων 400-500 βάσεις. Και γιατί μιλάμε πάντα για μέσο μέγεθος τμήματων. Γιατί είναι το μέγεθος αυτό που μπορεί να φτάσει σε ένα μηχάνημα με βάση τα ένδυση που χρησιμοποιεί την φυσιολογία των αντιδράσεων και το καθεξής. Σητήσαμε ακριβώς τι μπορεί να πάει στραβάσει σε ένα μηχάνημα IBI, ότι από κάποιο στιγμή και μετά η πολυμεράση δεν δουλεύει. Εντάξει έτσι κι αντίσχα και εδώ πέρα η πολυμεράση με όλα αυτά που γίνονται και τα λοιπά μπορούσε να δουλέψει μέχρι 400-500 βάσεις. Το 454 λοιπόν είναι ένα βασικό βασικό μηχάνημα το οποίο χρησιμοποιήθηκε πάρα πολύ. Ένα άλλο μηχάνημα που ήταν πάλι της IBI προσπαθώντας να πάει στο Next Generation C21, το Solid, που βλέπετε εδώ πέρα πάμε ακόμα και δύο τάξεις μεγέτης πιο ψηλά, ταυτόχρονα γίνονται 100 εκατομμύρια αντιδράσεις. Αλλά ποιο είναι το μειονέκτημα αυτών των μηχανημάτων, το μέσο μέγεθος των διαβασμάτων είναι μικρό. Αυτό που λέγαμε πολλές φορές και στα πρώτα μαθήματα ότι μπορεί να παίρνεις πολύ μικρά κομματάκια το οποίο μας δημιουργεί πρόβλημα. Τις επαναλαμβανόμενες και μετά ακόμα περισσότερο σε τι, ναι. Συνομολόγηση, εντάξει. Και αυτό το μηχάνημα που είναι το πιο επιτυχημένο μακράν και θα το δούμε πολλές φορές είναι τα μηχανήματα ηλούμινα. Δηλαδή ηλούμινα θα την ξέρετε την εταιρεία. Ίσως έχετε δει πόσοι από εσάς είδατε να αναλέει ηλούμινα μηχάνημα στις εργασίες τις οποίες διαβάσατε. Το διαβάζετε, το είδατε πάρα πολύ, βλέπετε. Πόσοι από εσάς είδατε 4.54 μηχάνημα ΙΡΩΣ. Άρα λοιπόν βλέπετε ότι ήδη όλες αυτές τις εργασίες που διαβάζετε χρησιμοποιούν αυτά τα μηχανήματα για να μπορέσουν να χρησιμοποιηθούν και να πάρεις αποτελέσματα σύγκουνση. Εδώ τότε, όταν βγήκαν αυτά, είχαμε ακόμα μικρό κομμάτι που μπορούσαν να διαβάσουν μέσω μέγεθος. Ήδη έχει μεγαλώσει. Αυτό θα το δούμε παρακάτω. Αυτό που θέλω να κρατήσετε βέβαια και θα δούμε και πώς έχει αναπτυχθεί η τεχνολογία της αλληλούχησης είναι το ότι το 2ο τρίμινο του 2014 ηλούμινα δήλωσε κέρδη στις μετοχές της 57% και ήταν κατά πάση πιθανότητα η μεγαλύτερη αύξηση όσον αφορά τα κέρδη της εταιρείας σε όλη την ιστορία. Δηλαδή βλέπετε ότι η ηλούμινα Μακράν είναι η πιο επιτυχημένη εταιρεία αυτή τη στιγμή στο next generation sequencing. Θα συζητήσουμε γιατί. Να δούμε λίγο και πώς δουλεύει λίγο το ηλούμινα το μηχάνημα. Ένα τέλος από τα πολλά που υπάρχουν. Σε όλες τις περιπτώσεις, ειδικά εφόσον μιλάμε για μηχανήματα 2ης γενιάς και θα συζητήσουμε λίγο και για μηχανήματα 3ης γενιάς κάποια στιγμή είναι το ότι χρειάζεται να πάρουμε το DNA μας, να το κάνουμε κάποιο είδος βιβλιοθήκης, να το ενισχύσουμε και μετά αφού πάρουμε πολλά αντίγραφα από το αρχικό μας το κομμάτι το DNA να το αλληλουχίσουμε. Εντάξει, το κρατάμε αυτό. Στο πρώτο κομμάτι λοιπόν αυτό που θέλει και η ηλούμινα είναι να μπορέσει να δημιουργήσει τις βιβλιοθήκες. Άρα λοιπόν παίρνει το κομμάτι το DNA και το σπάζει σε μικρά κομματάκια, βάζουμε και μια τελική αδενήνη και εδώ πέρα πάλι όπως με την ίδια λογική περίοδο και στο 454 βάζουμε αντάπτορες στα αριστερά και δεξιά. Εδώ τώρα διαφέρει εντολώς από το 454 γιατί αυτό που χρησιμοποιεί η ηλούμινα σαν τρόπο να ενισχύσει το DNA, δεν είναι το emulsion PCR αλλά είναι το bridge PCR, θα δημιουργηθούν κάτι σαν γέφυρες. Έχουμε την κατάλληλη επιφάνεια σαν πάνω στον οποίο υπάρχουν οι συμπληρωματικοί αντάπτορες στην αλληλουχία που έχουμε βάλει στα μικρά μας τα κομμάτια. Πάει και κολλάει αυτό το κομμάτι DNA και εδώ πέρα πια γίνεται το PCR και βλέπετε ότι έτσι όπως γίνεται το PCR πάει και κολλάει και μας δημιουργεί γέφυρες. Αλλά το θέμα είναι ότι σε κάθε περιοχή ξεχωριστή επάνω στην επιφάνεια υπάρχει ένα ξεχωριστό κλάστερ που περιλαμβάνει πολλά αντίγραφα από το ίδιο μας το μόριο. Από τη στιγμή που γίνει και αυτό και είναι έτοιμο το PCR μας είμαστε έτοιμοι για sequencing. Εδώ πέρα πάλι δουλεύουμε με laser το οποίο πάλι ελέγχει την προσθήκη βάσης με βάση το φως. Κρατάμε εδώ πέρα σε όλα αυτά τα μηχανήματα το βασικό τους κοινό χαρακτηριστικό ότι για να δουλέψουμε και να μπορέσουμε να ανοιχνεύσουμε την προσθήκη του νεοκλαιοτηδίου είτε το καθένα ξεχωριστά στα 454 είτε όλα μαζί στο Ιλούμινα είναι ότι φεύγει φως. Χρειαζόμαστε laser, χρειαζόμαστε φωτοευαίσθητα τεχνικές και χρειαζόμαστε λοιπόν αρκετή τεχνολογία που έχει και αρκετά ακριβή τεχνολογία γιατί πρέπει να προσθέτουμε αυτά τα νουκλοτίδια τα οποία απελευθερώνουν φως. Το μεγάλο πλεονέκτημα της Ιλούμινα επίσης ότι έχει πολύ πολύ ψηλή ακρίβεια. Άρα είδαμε το 454 και το Ιλούμινα είδατε πώς δουλεύει με βάση ευαίσθητα και φωσφορίου σε σχοστικές και κάποια στιγμή ήρθε ένα καινούριο μηχάνημα. Το καινούριο μηχάνημα είναι το Ιον Τόρεντ. Πέτυχε κανείς από εσάς να κάνει ένα μηχάνημα Ιον Τόρεντ στις αλληλουχίες, στις αλληλουχίες των γωνιδιωμάτων. Το μηχάνημα αυτό βασίζεται με την ίδια λογική στα Massively Parallel Sequencing δηλαδή κάνουμε πολλές φορές ή έχουμε εκατομμύριο αντιδραστήρες αλλά ποιο είναι το μεγάλο χαρακτηριστικό και η διαφορά αυτού του μηχανήματος. Ότι εδώ βλέπετε ότι έχουμε 1,2 εκατομμύριο θέση για αντιδράσεις. Αντί να χρησιμοποιούμε χρωστικές και να χρησιμοποιούμε φωσφορίζοντες χρωστικές αυτό το οποίο βασιζόμαστε είναι ότι υπάρχει τρόπος να αναγνωρίσουμε την αλλαγή του pH από τα ιόντα που πελευθερώνονται όταν προσθέτουν οι βάσεις. Άρα λοιπόν ποια είναι η μεγάλη διαφορά. Ότι δεν χρειάζεται να ξοδεύουμε πάρα πολλά χρήματα σε φωσφορίζοντες χρωστικές αλλά απλώς βασιζόμαστε φυσικοχημικές ιδιότητες σε μια επελευθέρωση ενός ιόντος άρα λοιπόν δεν ξοδεύουμε τόσο πολλά χρήματα. Άρα αυτό το μηχάνημα, αυτό το οποίο είχε σαν μεγάλο πλεονέκτημα, ήταν πολύ πιο φθηνό. Και έτσι λοιπόν βγήκαν τα PGMs, personal genome machines, τα οποία είναι ήδη αρκετά πετυχημένα. Και μετά από αυτά αυτό που μας βγήκε είναι τα μηχανήματα λούιξης τρίτης γενιάς. Και γιατί τρίτης γενιάς. Μέχρι τώρα τη συζητήσαμε. Συζητήσαμε τα μηχανήματα πρώτης γενιάς που γινόντουσαν μικρές αντιδράσεις, ετοιμάζαμε την αντίδρασή μας ξεχωριστά και μετά τη βάζαμε εν ισχύει με το DNA μας και μετά μπορούσαμε να κάνουμε αλληλούχηση. Μετά κάναμε τα μηχανήματα δεύτερης γενιάς τα οποία κάναμε εκατομμύρια αντιδράσεις τέτοια. Άρα λοιπόν μπορούσαμε να διαβάσουμε εκατομμύρια κομμάτια μετά από PCR. Η μεγάλη διαφορά στα μηχανήματα τρίτης γενιάς ποια είναι? Πες, θες να πεις. Ναι. Εννοώ ότι τα κομμάτια που θέλουμε να διαβάσουμε, αυτά πρέπει πρώτα απ' όλα να τα ενισχύσουμε, να κάνουμε αντιδράσεις PCR και μετά να κάνουμε την αντίδραση του sequencing. Έπρεπε να έχουμε πολύ υπόστρωμα, πολύ μεγάλη ποσότητα υποστρώματος στην αντίδραση του sequencing για να μπορέσουμε να διαβάσουμε το αποτέλεσμά μας. Εδώ πέρα τι γίνεται? Ότι τώρα πια δεν χρειάζεται να ενισχύσουμε το υπόστρωμά μας πριν πάει για sequencing. Άρα τι κερδίζουμε πάλι σε πάρα πολύ χρόνο αλλά και χρήμα. Το καταλαβαίνετε γιατί παλιά έπρεπε να ενισχύσουμε με PCR το κομμάτι μας και μετά να το διαβάσουμε. Τώρα κατευθείαν το κομμάτι το οποίο μας ενδιαφέρει μπορούμε να το διαβάσουμε απευθείας. Άρα ξεφεύγουμε από το ενδιάμεσο στάδιο της ενίσχυσης του κομματιού μας που είναι πάρα πολύ σημαντικό από απόψικός τους. Άρα λοιπόν αυτό τι σημαίνει ότι μπορούμε να διαβάσουμε την αλληλουχία του υπάρχοντος κλόνου. Δεν χρειάζεται να τον ενισχύσουμε αυτό τον κλόνο ξανά και ξανά και ξανά. Και έτσι λοιπόν μπορούμε να παίρνουμε πολλές αλληλουχίες από το ίδιο κύταρο από διαφορετικά κύταρα από διαφορετικούς εις τους για να πάρουμε τελικά μια ιδέα το τι γίνεται. Έτσι λοιπόν έχουν ευγή μηχανήματα όπως η Pacific Bioscience που σε αυτή θα εστιάσουμε. Και μετά θα δείξουμε και ένα ακόμα το οποίο είναι το πιο εντυπωσιακό. Πουλάει ότι όλοι εμείς θα τα κάνουμε καλύτερα από όλους. Όπως βλέπετε εδώ πέρα μιλάμε για single molecule sequencing σε real time. Η πολυμεράς συγκεβάζει και αντιγράφει το κομμάτι του DNA εντάξει προσθένοντας νοικλοτήδια αυτό το ξέρετε. Το καταφέρνει τελικά αυτό με βάση δύο διαφορετικούς εξελίξεις στην τεχνολογία του sequencing. Η Pacific Bioscience τι παραπάνω έχει καταφέρει. Προσθένεται λοιπόν νοικλοτήδια τα οποία έχουν τη χρυστική πάνω στη φωσφορική ομάδα οπότε με το που προστίθεται το νοικλοτήδιο αμέσως απελευθερώνεται αυτό το φωσφορίζων φωσφορική ομάδα. Άρα λοιπόν κάθε φορά που προσθέτεται ένα νοικλοτήδιο αμέσως απελευθερώνεται φως. Η μεγάλη όμως διαφορά αυτών των μηχανημάτων είναι το ότι έχουμε πια τέτοιο ικανότητα νυχνευτή ώστε κάθε φορά που προσθέτεται αυτό το νοικλοτήδιο και βγαίνει το φως μπορούμε να τον νυχνεύσουμε. Και αυτό γίνεται όχι μόνο σε ένα τέτοιο πηγαδάκι το οποίο είναι 70 νανόμετρο όλο και όλο το κάθε πηγαδάκι. Βλέπετε από κάτω υπάρχει το laser που σκανάρει το τι υπάρχει και τι βγαίνει. Οπότε κάθε φορά που θα απελευθερωθεί το φως από την προσθήκη του νοικλοτηδίου αμέσως παίρνουμε μια κορυφή η οποία κρατάει για μίλι δευτερόλεπτα, μίλι σέκοντς. Το φως το οποίο απελευθερώνεται, νυχνεύεται κιόλας. Και βλέπετε ότι αυτό γίνεται πάλι σε χιλιάδες αντιδραστήρες. Και μετά μπορούμε να συναρμολογίσουμε. Αυτό το οποίο θέλω να καταλάβετε ποιο είναι όμως αυτή την περίπτωση. Τι είναι αυτό το οποίο κατάφερνε τα μηχανήματα τρίτης γενιάς σε σχέση με τα μηχανήματα δεύτερης γενιάς. Ποιο είναι το μεγάλο πλεονέκτημα αυτών των μηχανημάτων. Να μην χρειάζεται ενίσχυση, αλλά γιατί καταφέρνουν να μην χρειάζεται ενίσχυση. Τι ήταν αυτή η πιστημονική, η πρόοδος που μπορέσαν να έχουν, ώστε τελικά να μην τους ενδιαφέρνει να έχουμε ενίσχυση του αρχικού του DNA τους. Ωραία, αυτό όμως πάντα γινότανε, πάντα χρησιμοποιούσαμε τον αρχικό τον κλόνο για να προσθέσουμε τον δεύτερο, να κάνουμε τον θυκατρικό τον κλόνο και να διαβάσουμε τι συμβαίνει κατά την προσθήκη αυτών των νυκλωτηδίων ας πούμε. Και στα μηχανήματα δεύτερης γενιάς, με το που προσθέτεται ένα νυκλωτήδιο, είτε βγαίνει φως, βλέπε μηχάνημα 454 λούμινα, είτε ανοιχνεύουμε την αλλαγή του Ιόντος, βλέπε μηχάνημα Ιον Τόρεντ. Εδώ πέρα τι είναι αυτό που καταφέναν τα μηχανήματα τρίτης γενιάς το παραπάνω. Από ένα νυκλωτήδιο. Από ένα νυκλωτήδιο, τι σημαίνει αυτό, τι κατάφεναν αυτά τα μηχανήματα, ποια ήταν η πιστημονική τους πρόοδος αυτών των μηχανημάτων. Σε κάθε περίπτωση όλα αυτά τα μηχανήματα τι χρειάζεται να καταφέρουν. Χρειάζεται να καταλάβουν ποιο είναι το σήμα και ποιος είναι ο θόρυβος. Δηλαδή παλιά δεν είχαμε αρκετά καλούς και ισχυρούς ανοιχνευτές στο να καταλάβουμε με την προσθήκη του ενός νυκλωτήδιου ότι θα πάρουμε τόσο φως ώστε να μπορέσουμε να το ανοιχνεύσουμε. Χρειαζόμασταν να έχουμε πολλά αντίγραφα από το ίδιο μας το κομμάτι των DNA, ώστε όπως έχουμε πολλά αντίγραφα θα προσθέτονταν πολλά νυκλωτήδια ατζία στην ίδια θέση είτε στο ίδιο κλάστερ στο Ιλούμινα, είτε στο ίδιο σφαιρίδιο στο 454, αλλά σε πολλά αντίγραφα, οπότε το συνολικό φως που θα βγει από αυτή την προσθήκη να είναι αρκετά ισχυρό για να έχουμε τον κατάλληλο ανοιχνευτή να το ανοιχνεύσει και να το καταγράψει. Τα μηχανήματα της γενιάς τι έχουν καταφέρει. Ότι έχουν τέτοιους ανοιχνευτές που ακόμα και από την προσθήκη ενός νυκλωτήδιου, το φως το οποίο παράγεται, έχουμε ισχυρό ανοιχνευτή να το ανοιχνεύσει και να το καταγράψει. Εντάξει. Και ποιο είναι πάντα το πρόβλημα σε όλες αυτές τις περιπτώσεις. Γιατί πάντα σκεφτείτε ότι, ναι, έχουμε τα νυκλωτήδια μας μέσα στα εκατομμύρια αντιδραστήρες. Τι υπάρχει μέσα σε όλο αυτό. Υπάρχει και απίστευτος τόρυβος. Γιατί υπάρχουν και πάρα πολλά νυκλωτήδια, τα οποία έτσι και έτσι από μόνο τους μπορεί κάποιες φορές να εκπέμψουν φως. Αυτό που βγάζει από μόνο του φως είναι τόρυβος. Παλαιά χρειαζόμασταν πάρα πολλή ποσότητα παραγώμανου σήματος, γιατί δεν μπορούσαμε να το διαφορετήσουμε από το τόρυβο. Τα μηχανήματα τρίτης γενιάς έχουν αυτή την δυνατότητα. Εντάξει. Το καταλάβατε, γιατί είναι πιο καλά αυτά τα μηχανήματα. Πολύ πιο καλά. Δεν είναι απόλυτα πιο καλά. Ακόμα έχουν δουλειά μπροστά τους, ακόμα πρέπει να αναπτυχθεί η τεχνολογία, αλλά πάντως πάνε προς τη σωστή κατεύθυνση. Εδώ πέρα. Και με αυτό θα τελειώσουμε. Δείτε ένα τελευταίο μηχάνημα sequencing. Ένα μηχάνημα sequencing σχεδόν όσο ένα USB. Να δούμε λίγο ακριβώς πώς δουλεύει, γιατί είναι αρκετά... Το μηχάνημα αυτό είναι σχεδόν ο συνδυασμός μηχανήματος Ion-Torrent. Βλέπετε ότι λέγεται MinION, αν και άλλες εταιρείες. Δηλαδή βασίζεται σε Ion. Και είναι και ταυτόχρονα τρίτης γενιάς, που σημαίνουν ότι δεν χρειάζεται να κάνουμε εκατομμύρια αντιδράσεις. Είναι το πιο εντυπωσιακό. Έχει ένα δυο χρόνια που έχει βγει. Το βλέπετε πως είναι. Το συνδέεσαι απευθείας στον υπολογιστή σου και πάνω ακριβώς δουλεύεις. Άλλη εταιρεία, άλλο μηχάνημα. Ήδη έχετε μπερδευτεί με αυτά τα μηχανήματα που έχετε ακούσει, αλλά τουλάχιστον να σας μείνουν δύο-τρία πράγματα, θα τα πούμε και μετά στο τέλος. Εδώ πέρα δεν χρησιμοποιείται ανοιχνευτής αυτός κατά αυτός, ο οποίος είναι έναν ανωπόρι που τελειώνει με συγκεκριμένες πρωτεΐνες, οι οποίες έχουν φυσικοχημικές ιδιότητες. Βλέπεις το μηχάνημα αλληλούχησης με τον υπολογιστή σου. Και μέσα εκεί πέρα έχεις και το software, έχεις και τα πανηφορμάτια, έχεις τα πάντα. Και βεβαίως όλα αυτά συνδέονται και με cloud. Δεν συνδέονται μόνο αυτό το υπολογιστή. Για την ώρα δεν μας ενδιαφέρουν οι διαφορετικές εφαρμογές του sequencing. Βασιζόμαστε μόνο στο DNA sequence γεγονιδιώματα. Μετά θα το δούμε αυτό. Εδώ είναι άλλες εφαρμογές. Δεν μας ενδιαφέρουν να δούμε έκφραση πρωτεΐνών ή οτιδήποτε άλλο. Θα πάμε λίγο σε αυτό το DNA sequencing. Αυτό είναι όλο και όλο. Είναι απίστευτο. Ετοιμάζεις το DNA σου και το βάζεις στη βιβλιοθήκη σου. Στο σημείο μέσα εδώ πέρα σε αυτό το μηχάνημα. Το φορτώνεις. Και μπαίνουν σε διαφορετικά κανάλια σε διαφορετικούς πόρους. Με τους νονοπόρους. Κάθε πόρος έχει διαφορετικό κανάλι. Εδώ βασίζεται στο γεγονός ότι κάθε φορά που περνάει, δεν έχουμε τόσο σύνθεση, αλλά κάθε φορά που περνάει το διαφορετικό νοικλοτίδιο, βλέπουμε και ποια είναι το νοικλοτίδιο το οποίο περνάει από εκεί μέσα από το μπόρο. Κάθε φορά που περνάει διαφορετικό νοικλοτίδιο, βλέπουμε και ποια είναι το διαφορετικό νοικλοτίδιο το οποίο περνάει από εκεί μέσα από το μπόρο. Βλέπουμε και ποια είναι το διαφορετικό νοικλοτίδιο το οποίο περνάει από εκεί μέσα από το μπόρο. Κάθε φορά που περνάει διαφορετικό νοικλοτίδιο μέσα από το μπόρο, αλλάζει διαφορετικά η φυσικοχημική ιδιότητα μέσα από το μπόρο. Οπότε διαφορετικό νοικλοτίδιο προκαλεί διαφορετική αλλαγή μέσα από το μπόρο. Άρα λοιπόν, δεν έχουμε σύνθεση, αλλά έχουμε αλλαγή των φυσικοχημικών ιδιωτήτων του νανοπόρου. Κάθε φορά που περνάει καταγράφεται και έχουμε ολόκληρη την πληροφορία. Ακόμα αυτά τα μηχανήματα δεν είναι τόσο ακριβείς στα αποτελέσματά τους. Συμπερασματικά θα δούμε διάφορους τέτοιους σχεδιαγράμματα. Εδώ βλέπετε διαφορετικά μηχανήματα next-generation sequencing και πώς αναπτύχθηκαν η τεχνολογία τους και πώς παραγωγή δεδομένων μπορούσαμε να πάρουμε. Από το 2005 που εμφανίστηκε το ροζ με μπλε, το 454 δηλαδή, τότε παίρναμε μέσω μέγεθος 100 βάσεις, μετά φτάσαμε με 250, μετά 450, μετά 800 βάσεις σαν μέσω μέγεθος. Αυτόχρον η 454 έβγαλε και ένα άλλο μηχάνημα κάποια στιγμή, το 454 Junior, που δεν κόστιζε τόσο πολύ, που έπαιρνε σαν μέσω μέγεθος 400 βάσεις. Βλέπετε βέβαια ταυτόχρονα και ποια ήταν η παραγωγή σε δεδομένα αυτών των μηχανημάτων. Έτσι λοιπόν είχαμε τη δυνατότητα να παράγουμε ένα γιγαμπέιση δεδομένων με αυτά τα μηχανήματα τα 454 το 2011-2012. Από το 2007 αρχίζουν και εμφανίζονται και τα μηχανήματα solid με κόκκινο και ηλούμινα με πράσινο. Βλέπετε πώς αυξάνεται το μέσο μέγεθος του διαβασμάτων αυτών των μηχανημάτων και πώς και της ηλούμινα αυξάνεται αυτό το μέγεθος. Ποια είναι η μεγάλη διαφορά που μπορείτε να δείτε ανάμεσα στα μηχανήματα solid ηλούμινα και στα μηχανήματα 454. Ότι ναι μεν τα 454 τα μηχανήματα διαβάζουν μεγαλύτερο μέσο μέγεθος 800 βάσεις σε σχέση με 100 ή 75 αλλά τα μηχανήματα αυτά παράγουν πολύ πολύ περισσότερα δεδομένα γιατί έχουν πολύ μεγαλύτερη ικανότητα να παράγουν πολλά εκατομμύρια αντιδράσεις και πολλές περισσότερες πληροφορίες. Άρα για κάντε λίγο τη σύγκριση. Στη μια περίπτωση παίρνουμε μεγαλύτερα κομμάτια αλλά λιγότερα τέτοια μεγαλύτερα κομμάτια ενώ στην άλλη περίπτωση παίρνουμε μικρότερα κομμάτια αλλά παίρνουμε πολύ περισσότερα από αυτά τα μεγαλύτερα κομμάτια. Άρα ή θα κάνουμε συναρμολόγηση η οποία θα μας βοηθάει άμα θέλουμε κάτι εντελώς καινούριο χρειαζόμαστε μεγάλα κομμάτια να μπορέσουμε να συναρμολογήσουμε δηλαδή θα είμαστε σίγουροι για ποιο θέμα. Για την ακρίβεια των αποτελεσμάτων μας ή θα έχουμε μικρά μικρά κομματάκια τα οποία όπως επειδή δεν τα έχουμε διαβάσει πολλές φορές θα είμαστε πιο σίγουροι για την ακρίβεια των αποτελεσμάτων μας. Θα ξέρουμε ότι αυτό είναι λάθος ή πολυμορφισμός αυτό που λέγαμε στην αρχή των μαθημάτων. Το καταλάβατε αυτό. Και άμα το δούμε και ακόμα πιο πρόσφατα αυτό νομίζουμε το 2013 εδώ για την αρχή θα γίνεται ένας μεγαλύτερος χαμός. Βλέπετε ας πούμε τι ποσότητα δεδομένων μπορούμε να πάρουμε. Το σάγγερ το μηχάνημα πολύ χαμηλά όσον αφορά τη μηχανότητα την ποσότητα δεδομένων μπορούμε να πάρουμε. Αλλά πάνω κάτω βλέπετε ότι το μέσο μέγεθος των διαβασμάτων στο σάγγερ είναι 1000 βάση πια έχει φτάσει. Τα solid και τα λοιπά είναι πιο χαμηλά στα 100. Αλλά βλέπετε ότι υπάρχουν τώρα το Hi-sec 2000 η λούμινα πάλι και αυτό, το Hi-sec 2500 η λούμινα πάλι και αυτό, το My-sec η λούμινα πάλι και αυτό. Που πένει στα My-sec είναι μικρότερης ποσότητας δεδομένων αλλά είναι και πιο φθηνά. Δηλαδή όταν έχεις ένα μεγάλο εργαστήριο στο Harvard ή στο BGI κτλ που θέλεις να παράγεις εκατομμύρια δεδομένων και έχεις κάποιον ενδιαφέρον να πάρει τόσα πολλά δεδομένα θα πάρεις ένα Hi-sec μηχάνημα και έχεις και τα χρήματα βεβαίως. Άμα δεν έχεις τόσα πολλά να κάνεις, δεν έχεις τόσα πολλά χρήματα, δεν έχεις τόσα πολλά διαφορετικά ρευνητικά προγράμματα να δουλέψεις αλλά θέλεις να έχεις ένα δικό σου μηχάνημα στο δικό σου εργαστήριο τότε μπορεί να πάρεις ένα My-sec μηχάνημα. Αυτό το οποίο επίσης βλέπετε είναι ότι αυτό το οποίο αρχίζει και αυξάνει όλο και περισσότερο το μέσο μέγεθος διαβασμάτων είναι το Pacific Bioscience που σας έδειξα που θα δούμε και που έχει φτάσει. Ήδη εδώ πέρα φαίνεται να αρχίζει να πλησιάσει στις 10.000 βάσεις ένα διάβασμα όλο και όλο κατά μέσο όρο. Συγκρίνοντας επίσης πάλι, θα δούμε διάφορες τέτοιες συγκρίσεις, βλέπετε ότι τα μηχανήματα, τα ηλούμινα και τα σόλ, χρειαζόντουσαν 8 μέρες για να τρέξουν και πάλι πόσες, ας πούμε, κατομμύρια διαβασμάτων μπορούσε να πάρεις, δείτε πόσο πολύ περισσότερα διαβάσματα παίρνει σε σχέση με το 454, το 454 θα δώσει 1 εκατομμύριο διαβάσματα, το ηλούμινα θα σου δώσει 500 εκατομμύριο διαβάσματα, αυτό που είπαμε πολλές φορές αντίγραφα από την ίδια περιοχή. Και βεβαίως όπως σας είπα όλα αυτά τα μηχανήματα συνεχώς προχωράνε, το 2010 υπήρχε το Hi-Sec 2000, το Hi-Sec 1000, το Hi-Scan, το Genome Analyzer και το My-Sec, το 2014 η ηλούμινα πάλι έχει κρατήσει το My-Sec, έχει βγάλει καινούργια Hi-Sec και έχει βγάλει και το Hi-Sec Epi-10, το οποίο θα ζητήσουμε ακριβώς τι κάνει λίγο πιο μετά. Το αυτό που έχει τη μεγαλύτερη σημασία βέβαια σε όλη αυτή την διαδικασία είναι το κόστος. Άρα λοιπόν πόσο θα ξοδέψουμε για να μπορέσουμε, είτε να αγοράσουμε ένα τέτοιο μηχάνο, είτε τελικά να μπορέσουμε να πάρουμε και τις αλληλουχίες οι οποίες μας ενδιαφέρουν. Και όπως ήδη το συζητήσαμε, έχουμε δύο μεγάλες ομάδες, είτε τα ηλούμινα solid, τα οποία παίρνεις μικραίου μεγέθους αλληλουχίες αλλά με πάρα πολύ μεγάλο αριθμό αυτού των αλληλουχιών, άρα λοιπόν πέφτει πολύ το κόστος ένα εκατομμύριο βάσεων, ή έχεις ένα μέτριο αριθμό διαβασμάτων αλλά μεγάλου μεγέθους οπότε τελικά βγαίνει σχετικά μεγάλο το κόστος ένα εκατομμύριο βάσεις. Ίσως υποθετικά όταν μπορέσει να τελειοποιηθεί η τεχνολογία τρίτης γενιάς, να μπορούμε να έχουμε πολλά διαβάσματα με μεγάλο μέγεθος οπότε τελικά να έχουμε χαμηλό κόστος. Πάντως αυτό που γενικά αυτή τη στιγμή γίνεται και αυτό το οποίο μπορεί να δείτε κι εσείς είναι το τι ανάλογα με το στόχο το οποίο έχουμε αποφασίζουμε και τι μηχανήματα θα χρησιμοποιήσουμε. Το έχουμε πει και άλλες φορές αλλά εδώ πέρα το λέει σαν συμπέρασμα. Για τενόβου αλληλουχίσεις προτείνεται ο συνδυασμός μηχανημάτων Ιλούμινα και 454. Τι σημαίνει για τενόβου αλληλουχίσεις. Για αλληλουχίσεις που δεν έχουμε ξαναγίνει ποτέ. Άρα αν μιλάμε για ένα βακτήριο ή για ένα ευκαιρωτικό οργανισμό ακόμα περισσότερο που δεν έχουμε κάποιον ή από το ίδιο είδος ή από κάποιο στενά συγγενικό είδος να μπορούμε να κάνουμε συγκριτική γωνιδιωματική καλύτερα να χρησιμοποιήσουμε και τα δύο μηχανήματα. Γιατί και τα δύο μηχανήματα. Προφανώς έχει να κάνει με τη στατιστική αλλά τι είναι αυτό ακριβώς που μας ενδιαφέρει. Το ένα να συνδυάσουμε με το άλλο. Τι είναι αυτό που λείπει από τη μια περίπτωση οπότε θέλουμε να το συνδυάσουμε με την άλλη. Ναι. Ποιο είναι το μεγάλο πρόβλημα στις τενόβου αλληλουχίσεις. Το είπαμε. Ποιο είναι το πρόβλημα. Συνορμολόγηση. Όταν έχεις ήδη κάποιο είδος το έχεις ήδη αλληλουχίσει το έχεις το γωνιδίωμά του. Άρα τι μπορείς να κάνεις μπορείς σαν να χρησιμοποιήσεις λούμινα μηχάνημα γιατί θα παίρνεις με μικρά μικρά κομματάκια αφού το έχεις ήδη το γωνιδίωμα ξέρεις πού να το βάλεις αυτό το κομμάτι να το κάνεις αλεινμεντ. Εντάξει. Με παρακολουθείτε. Όταν δεν το έχεις αυτό το γωνιδίωμα πρέπει να το συνορμολογείς από την αρχή. Θέλεις μεγάλα κομμάτια να μπορέσεις να τα συνδέσεις. Θέλεις πάζλ με μεγάλα κομμάτια οπότε να μπορείς να βρεις περίπου τι γίνεται. Σκεφτείτε να έχετε ένα πάζλ με εκατομμύρια κομματάκια και να μην έχετε ένα πρότυπο. Είναι σαν να θες να κάνεις ένα πάζλ αυτό θέλω. Το οποίο δεν έχεις καθόλου την εικόνα με μικρά μικρά κομματάκια που εκεί πέρα ψάχνεσαι ενώ όταν έχεις ας πούμε το γωνιδίωμα το πάζλ έχεις το μία εικόνα μπορείς να χρησιμοποιείς και τα μικρά μικρά κομματάκια μόνο γιατί ξέρεις πού να τα βάλεις. Άμα δεν έχεις καμιά εικόνα θες και μεγάλα κομματάκια περίπου να αρχίσεις να καταλάβεις ποια είναι η συνολική εικόνα. Εντάξει. Να δούμε λίγο τιμές των μηχανημάτων. Τα μηχανήματα αυτά δεν είναι και φθηνά. Εδώ μιλάμε για thousands of US dollars. Άρα λοιπόν αυτό το μηχανήμα του S5S κάνει 500.000 δολάρια. Τα Illumina επίσης κάνουν περίπου 400, 200, 600.000 δολάρια. Τα πιο φθηνά από όλα αυτή τη στιγμή είναι τα Ion Torrent τα οποία κάνουν 50.000 δολάρια. 50.000 δολάρια δεν έχει κανέναν απαγορευτικό ποσό. Το θέμα είναι βέβαια κατά πόσο το χρειάζεσαι. Εδώ πέρα κάνω μια παρένθεση και είναι αυτό που λέω έτσι κι αλλιώς. Αυτά τα μηχανήματα δεν είναι απαραίτητο να υπάρχουν στο οποιοδήποτε εργαστήριο. Το έχω πει κι άλλη φορά. Για το δικό μας το εργαστήριο, το οποίο δεν έχει τρελή παραγωγή δεδομένων έτσι κι αλλιώς, δεν έχει και μεγάλα προγράμματα, με το κάνω τι να ξοδέψω 50.000 δολάρια κι ακόμα περισσότερο 200.000 δολάρια να πάρω να μη χάνω, με το ποιο μετά θα το κάνω. Πότε θα το χρησιμοποιήσω δηλαδή. Στι μια, δυο, τρεις φορές που θα παράγω δεδομένα που θα έχω τόσα πολλά δεδομένα να δουλέψουν οι φοιτητές μου για χρόνια, όχι. Άρα που δουλεύει πια σε πάρα πολλές περιπτώσεις όλο αυτό το λεγόμενο outsourcing. Σας το έχω ξαναπεί ή όχι. Τι σημαίνει outsourcing. Σημαίνει ότι σου παρέχει την υπηρεσία κάποιος άλλος. Άρα λοιπόν, αντί εγώ να αγοράσω ένα μηχάνημα 454, μπορώ να πάω και να ζητήσω από μια εταιρεία που έχει τέτοια μηχανήματα να τη στείλω εγώ το DNA μου και να τους πω κάνε μου εσύ την αλληλούχηση, θα σου πληρώσω εγώ την αλληλούχηση και εγώ μετά θα κάνω την ανάλυση των δεδομένων. Αυτή τη στιγμή η μεταπτυχιακή μου φοιτήτρια έχει πάει στην Ισπανία όπου συνεργάζεται με μια άλλη φοιτήτρια, η Ισπανίδα, κάνουν ανάλυση βιοκοινότητας και σε σχέση με invasive species σε λιμάνια στην Ελλάδα και στην Ισπανία. Έχουν μαζέψει το DNA από λιμάνια εδώ πέρα, έχει μαζέψει και η Ισπανίδα από λιμάνια στην Ισπανία και τι θα κάνουν μετά. Όχι και το εργαστήριο στην Ισπανία έχει μηχανήμα 454 αλλά θα τα στείλουν για outsourcing, πληρώνεις λίγα χρήματα, πληρώνεις περίπου 2 με 3 χιλιάδες για το ένα το run, για το ένα το τρέξιμο δηλαδή του μηχανήματος. Άρα λοιπόν, τι μπορείς να κάνεις μια χαρά, να μπορέσεις να πάρεις μετά, δηλαδή με 5 χιλιάδες, με 10 χιλιάδες, εγώ σου λέω με 20 χιλιάδες μπορείς να πάρεις πάρα πολλά δεδομένα και μετά να δουλέψεις. Και το θέμα δεν είναι να το έχεις το μηχάνημα, το θέμα είναι να παράγεις τα δεδομένα και μετά να μπορέσεις να τα αναλύσεις και αυτό θα γίνει σε πάρα πολλές περιπτώσεις. Δείτε λίγο και κάτι ακόμα το οποίο με ενδιαφέρει εδώ πέρα. Εδώ βλέπετε πόσο θα πληρώσεις άμα θέλεις να χρησιμοποιήσεις full μηχάνημα, εδώ πέρα ας πούμε για παράδειγμα σου λέει για να χρησιμοποιήσεις το full 4.54 θέλεις 12 χιλιάδες δολάρια. Αλλά και πάλι επειδή αυτά τα μηχανήματα τα plates δεν είναι απαραίωτο να γεμίσεις ένα full plate μπορείς να γεμίσεις το 1.8 του plate, το 1.4 του plate, το 1.2 του plate και πάλι για αυτό δεν χρειάζεται να πληρώσεις και τα 12 χιλιάδες δολάρια και τα 50 χιλιάδες δολάρια. Μπορείς να πληρώσεις ένα υπό πολλαπλάσιο αυτό ανάλογα με το πόσο θες να χρησιμοποιήσεις. Και ανάλογα με το πόσο χρησιμοποιήσεις βεβαίως τόση ποσότητα αποτελεσμάτων θα πάρεις και μετά αρχίσεις και σκέφτεσαι, ok άμα πάρω τόσα αποτελέσματα σημαίνει τόσα διαβάσματα για αυτό που θέλω εγώ να κάνω μου αρκεί, δεν μου αρκεί. Μετά αρχίσεις και πρέπει να μπεις στο βάθος της ανάλυσης ποιος είναι ο στόχος σου, πόση πληροφορία θέλεις, τι μηχάνημα θα χρησιμοποιήσεις και όλο αυτό το μπερδεμένο. Για εσάς δεν είναι σημαντικό να το καταλάβετε αυτό απλώς να ξέρετε ότι όταν έρθει η ώρα θα το ψάξετε και θα το βρείτε. Απλώς να καταλαβαίνετε ότι ανάλογα με το στόχο αποφασίζεις ποιο μηχάνημα. Αυτό το οποίο μας ενδιαφέρει επίσης είναι και το ποσοστό λαθών αυτών των μηχανημάτων. Βλέπετε ότι τα 454 έχουν 1% λάθη, τα Illumina 0,1% λάθη, τα Solid 0,01% λάθη. Άρα λοιπόν το πιο σωστό από όλα είναι σίγουρα το Solid. Αλλά μας αρκεί και το Illumina γι' αυτό είναι και τόσο επιτυχημένα. Και πάμε λίγο πιο κοντά στο σήμερα με μια εκτίμηση του 2013. Οι τιμές όπως βλέπετε για τα Illumina τα μηχανήματα συνεχίζουν να είναι υψηλές για το Hi-Sec. Φτάνουν με 700.000 δολάρια, το Ion Torrent 50.000 δολάρια. Αλλά δείτε λίγο το Pacific Biosciences το 2013 είχε μέχρι τους διαβασμάτων περίπου 5.000 βάσεις. Τα Illumina εκεί στα 300-500. Δείτε όμως τιμές μακράν από τα πιο φθηνά μηχανήματα είναι τα Illumina. Το Pacific Biosciences ναι μεν παράγει πολύ μεγάλο διάβασμα, αλλά ακόμα είναι πάρα πολύ ακριβό. Δεν μιλάμε σε επίπεδο sense, μιλάμε και σε επίπεδο δολαρίων. Άρα δεν αξίζει ακόμα να το χρησιμοποιήσεις, είναι πάρα πολύ ακριβό. Βέβαια πριν από ένα μήνα η Pacific Biosciences επελευθέρωσε στην αγορά ένα καινούργιο μηχάνο με καινούργια χημία, που σου υπόσχεται ότι το μέσο μέγεθος των διαβασμάτων είναι 10 με 15.000 βάσεις και μπορούμε να φτάσουμε ακόμα και 40.000 βάσεις το διάβασμα. Τώρα δηλαδή έγινε αυτό το πράγμα. Και τι γίνεται σε όλη αυτή τη δικασία. Κάποια μηχανήματα θα την πατήσουν. Η 454 πέρσι ανακοίνωσε ότι μετά από τόσο πολλή υποστήριξη και τόσα πολλά μπορούμε να καταφέρουμε, είπε πάπαλα. Ξεχάστε το, πάβουμε να παράγουμε μηχανήματα 454. Δεν τα βγάλαμε τα χρήματά μας τελικά. Άρα λοιπόν αυτό που σου λέει είναι ότι μέχρι το 2015 θα συνεχίσουμε με να παράγουμε μερικά 454 και θα τα υποστηρίζουμε, αλλά αυτό το που μας ενδιαφέρει πια στην αγορά να υποστηρίξουμε ίσως είναι το Pacific Biosciences. Που είναι η ίδια εταιρεία πάλι. Ο ίδιος όμως εταιρείας. Ελπίζοντας ότι ξεχνάω πια το μάρκετ για τα second generation sequencing, γιατί έχει σαρώσει η λούμινα, και να πάω στο third generation sequencing. Πάω και εκεί πέρα τα καταφέρω περισσότερο. Και η λούμινα βεβαίως αυτό το οποίο καταφέρνει μετά μεγάλη επιτυχία. Έβγαλε και αυτό που είπαμε το Hi-sec Epi-10, το οποίο επιτέλους είναι το πρώτο μηχάνημα, τα πρώτα μηχανήματα, γιατί δεν είναι ένα μηχάνημα, αγοράζει 10 μηχανήματα μαζί πρέπει να τα αγοράζει, όχι ένα, 10, με τιμή 10 εκατομμύρια βέβαια δολάρια, 10 εκατομμύρια δολάρια, όχι εκατοντάδες χιλιάδες, εκατομμύρια. Αλλά τι σου λέει, ότι μπορεί να παράγει 16 ανθρώπινες αγωνιδιώματα από 3 μέρες, δηλαδή 5 ανθρώπινες αγωνιδιώματα κάθε μέρα, μπορεί να παράγει 18 χιλιάδες ανθρώπινες αγωνιδιώματα το χρόνο, σε κάλυψη 30 επί, και αυτό γιατί το κατάφερα, γιατί με την καινούργη της τεχνολογίας, με τα καινούργια μηχανήματα, με όλα αυτά, μπορεί να έχει καλύτερο πακετάρισμα αντιδράσεων, μικροανιχνευτές, καλύτερη καταγραφή σήματος, καλύτερη πουθενότερη πολυμεράση, και μπορείς να μπορείς να τα καταφέρεις όλα αυτά. Είναι η πρώτη επίσημη έξοδος μηχανημάτων που σου υπόσχονται, ότι άμα έχεις ένα τέτοιο μηχάνημα, θα μπορέσεις, it's the first sequencing platform to break the 1000 genome barrier. Αυτό που λέγαμε πάντα εξ αρχής, ότι ο σκοπός μας είναι να μπορέσουμε να παράγουμε γωνιδιώματα με κόστος 1.000 δολάρια όλο και όλο το κάθε γωνιδίωμα, για να μπορέσει ο καθένας να κάνει γωνιδιώματος του, η Λούμινα το λέει, βέβαια για να το καταφέρεις αυτό, πρέπει να είσαι τέτοιο ερευνητικό κέντρο, που να έχεις 1 εκατομμύρια δολάρια, να αγοράσεις τα μηχανήματα αυτά καθ' αυτά. Αλλά προς τα εκεί πάμε. Βλέπετε εδώ τα μηχανήματα, η αντίσχευτη εταιρεία, η μέθοδος της αλληλούχησης και η μέθοδος ενίσχυσης. Βλέπετε τα μηχανήματα δεύτερης γενιάς είναι αυτά που έχουν ενίσχυση. PCR, PCR, PCR, PCR. Άρα λοιπόν το 454, το Ιλούμινα, το Σόλιτ, το Ιον Τόρεντ, είναι μηχανήματα second generation sequencing. Το Hellescope, ξεχάστε το, δεν υπάρχει πια, το Starlite, σχεδόν δεν υπάρχει επίσης, το Pacific Bioscience είναι μηχανήματα τρίτης γενιάς. Γιατί δεν υπάρχει αυτό το ενδιάμεσο στάδιο ενίσχυσης του DNA. Και βλέπετε ότι το 454 είναι το πρώτο μηχάνημα νέας γενιάς, με μεγάλο μέγεθος. Οι Ιλούμινα και Σόλιτ ήταν μηχανήματα μικρότερων διαβασμάτων. Το Ιον Τόρεντ είναι το πρώτο μηχάνημα αλληλούχησης νέας γενιάς, που δεν βασιζόταν στην εκπομπή Φωτός. Και το Pacific Bioscience είναι το πρώτο μηχάνημα αλληλούχησης με μονομένου μωρίου σε πραγματικό χρόνο, third generation sequencing. Ανάλογα τώρα, αρχίζουμε και μπαίνουμε και σε άλλα δεδομένα και σε άλλα μονοπάτια, που να τα χρησιμοποιήσουμε αυτά τα μηχανήματα. Δεν θα συζητήσουμε σήμερα τόσο αναλυτικά αυτό. Αφού τελειώσουμε, σας υπενθυμίζω ότι αυτή τη στιγμή είμαστε περισσότερο στη λογική της λειτουργικής γονιδιωματικής. Ποια είναι αυτά τα μηχανήματα πλατφόρμες, τα οποία μας επιτρέπουν να καταλάβουμε τη λειτουργία. Ασχολιόμαστε σήμερα με τα μηχανήματα αλληλούχησης, θα ασχοληθούμε με τα μηχανήματα μικροάρεης και θα πούμε και κάποια πράγματα για φαρματογράφους ΜΑΖΑΣ. Αφού δούμε αυτά τα τρία βασικά μηχανήματα πλατφόρμες, πάνω στα οποία βασίζει τη λειτουργική γονιδιωματική, μετά θα πάμε σε εφαρμογές πιο αναλυτικά. Απλώς να αρχίσουμε να λέμε και κάποιες άλλες εφαρμογές, που μπορούμε να δούμε, έτσι λοιπόν μπορούμε να έχουμε τενόβου αλληλούχηση σε βακτριακά γονιδιώματα ή και σε ευκαραιοτικά γονιδιώματα. Αλλά πέρα από αυτά μπορούμε να έχουμε και άλλες εφαρμογές, να δούμε το μεταγράφωμα, το RNA δηλαδή, μπορούμε να δούμε μεταλλάξεις και μπορούμε να δούμε και microRNAs με θυλιωμένες περιοχές, να δούμε τουλάχιστον άλλες 40 διαφορετικές εφαρμογές αυτών των μηχανημάτων. Αυτή τη στιγμή λένε ότι με αυτά τα μηχανήματα μπορείς να κάνεις 40 και διαφορετικές εφαρμογές. Κάποιες από αυτά σας δούμε πιο αναλυτικά στα επόμενα μαθήματα. Το ολοκληρώνουμε σιγά σιγά με κάποια παραδείγματα. Γιατί δείχνω αυτό το γονιδίωμα του πάντα? Γιατί το γονιδίωμα του πάντα ήταν το πρώτο γονιδίωμα στο οποίο χρησιμοποιήθηκε αποκλειστικά next generation sequencing. Ήταν η πρώτη περίπτωση που προσπαθήσαμε να κάνουμε ντενόβου αλληλούχηση σε ένα ευκαιρωτικό γονιδίωμα με next generation sequencing. Μέχρι τότε χρησιμοποιούσαμε και χαρτογράφηση, χρησιμοποιούσαμε και Sanger sequencing, χρησιμοποιούσαμε διάφορα τέτοια. Και ήταν ένα αποτέλεσμα το οποίο ήταν της BGI. Ήταν το πρώτο τέτοιο γονιδίωμα. Και κάποια άλλα πράγματα που θέλουμε να δούμε επίσης είναι να μας ξεκαθαρίσουν λίγο το τι σημαίνει ντενόβου αλληλούχηση και πόσο είναι η ντενόβου αλληλούχηση. Δεν είναι δύσκολη μόνο σε ευκαραιοτικά γονιδιώματα. Πάντα λέγαμε, θυμάστε που είχαμε τις πρώτες τις ειτήσεις, όταν μιλούσαμε και για βακτριακά γονιδιώματα, ότι επειδή ακριβώς δεν έχουν πολύ επαναλαμβανόμενο DNA, είναι σχετικά εύκολη η συνερμολόγηση αυτών των γονιδιωμάτων. Που όμως δεν είναι τόσο εύκολη. Η Pacific Biosciences σε μια εργασία του Περσινή, αυτό που λέει είναι ότι σε πολλά γονιδιώματα, ακόμα και σε βακτήρια και σε αρχαία, είχαμε προβλήματα. Και όταν κάνουμε συνερμολόγηση, ακόμα και εκεί πέρα, δεν μπορούσαμε να έχουμε ένα κόντι ξενολικό χωρίς καθόλου κενά, το οποίο αντιστοιχεί σε ολόκληρο το βακτριακό το γονιδίωμα. Είναι ακριβώς, άμα πάμε με μικρά μηχανηματάκια, μικρά, με ηλούμινα, με solid μηχανηματάκια που έχουν μικρό μέσο μέγεθος, η συνερμολόγηση δεν θα ήταν πάρα πολύ εύκολη. Οπότε η Pacific Biosciences λέει ότι με τις καινούργιες τις χημείες που έχουμε, έχουμε αναπτύξει πάρα πολύ τις τεχνολογίες μας και έχουμε φτάσει πια σε αυτή την εργασία του 2013, είπαμε, όπου το μέσο μέγεθος είναι 4.000 βάσεις και το μέγιστο τότε 27.000 βάσεις, μπορούν να πάρουν μεγαλύτερα κομμάτια. Και τι σημαίνει αυτό στην πράξη. Δείτε, για παράδειγμα, όταν έχεις μικρά μικρά κομματάκια, χρησιμοποιείς διάφορα μοντέλα για τα συνερμολογίσεις. Αυτό το οποίο λέγεται το De Bruijn Graphs, ας πούμε. Και δείτε ποιες είναι πιθανές συνερμολογίσεις κομματιών του puzzle, όταν αυτά τα κομμάτια είναι μικρά, όταν είναι λίγο μεγαλύτερα και όταν είναι πολύ μεγάλο το γωνιδίωμα. Είναι αυτό που λέγαμε πιο πριν. Μικρά κομματάκια, πολλές πιθανές λύσεις. Μεγαλύτερα κομματάκια, λιγότερες λύσεις. Ακόμα μεγαλύτερο κομμάτι μέσο μέγεθος, ακόμα πιο εύκολη συνερμολόγηση. Το καταλαβαίνετε ποιά χαρά οπτικά αυτό εδώ πέρα. Και ακριβώς αυτό που λέει είναι ότι μπορούμε να χωρίσουμε τα γωνιδιώματα, ανάλογα με την πολυπλοκότητά τους, σε τρεις κλάσεις. Υπάρχουν αυτά που είναι πολύ απλά, χωρίς καθόλου καθόλου επαναλαμβανόμενο DNA, που ακόμα και με απλά μηχανήματα μπορείς να πάρεις άνετα το γωνιδίωμα της συνερμολόγησης. Έχεις γωνιδιώματα τα οποία για να πάρεις ένα καλό αποτέλεσμα συνερμολόγησης χρειάζεσαι χρήση καλών μηχανημάτων με μεγάλα διαβάσματα και όπως λέει εδώ πέρα παρατηρήσει τον ολοκληρωμένο εξωτερικό κύκλο που δείχνει ότι έχουμε ολοκληρωμένη συνερμολόγηση με τη βοήθεια του Pacific Biosciences. Ενώ άμα έχεις και πιο πολύ πλοκαγωνιδιώματα ακόμα και σε σερρύχια κολλάει τότε ακόμα και σε περιπτώσεις που έχεις και καλά μηχανήματα με μεγάλα διαβάσματα πάρα δεν μπορείς να είσαι τόσο σίγουρος για το υλικό αποτέλεσμα πότε άμα χρησιμοποιήσεις αποκλειστικά και μόνο Next Generation Σύγκλωση μηχανήματα και δεν χρησιμοποιήσεις καθόλου χαρτογράφηση. Άμα κάνεις χαρτογράφηση βεβαίως θα σε βοηθήσει να κάνεις αυτή τη συνερμολόγηση. Το καταλάβατε, εντάξει. Τώρα, η συνερμολόγηση αυτή καθ' αυτή δεν θα σας κοροϊδέψω να σας πω ότι ξέρω πράγματα από αυτά. Απλώς αυτό που θέλω να σας μείνει είναι το ότι εφόσον υπάρχουν τόσο πολλά μηχανήματα, τόσο πολλές τεχνολογίες, τόσο πολλές χημίες, τόσο πολλές προσεγγίσεις υπάρχουν και πάρα πολλές βιοπληροφορικές προσεγγίσεις στο να κάνεις συνερμολόγηση. Μπορεί κάποιες εταιρίες να προτείνει τον δικό τους τρόπο να κάνεις συνερμολόγηση σε αποτελέσματα αλλά υπάρχουν πάρα πολλά τέτοια προγράμματα συνερμολόγησης αποτελεσμάτων. Ένα μπορεί να είναι το ABIS, άλλο μπορεί να είναι το SHOPE και υπάρχουν και διάφορες πληροφορίες. Εδώ πέρα, άμα έχετε όρεξη, δείτε αυτό το άρθρο στο Nature by Technology για αυτούς που θέλουν να γίνουν υπολογιστικοί βιολόγοι, να ασχολούν με την υπολογιστική βιολογία. Και εδώ απλώς μόνο σαν μια ιδέα να πάρετε σε ένα περιοδικό που λέγεται Giga Science, και είναι καινούριο περιοδικό, το 2013 πριν από ένα χρόνο. Δώσανε στην επιστημονική κοινότητα διαφορετικά δεδομένα από γονιδίωμα ψαριού, ερπετού και πουλιού και είπανε προσπαθήστε να χρησιμοποιήσετε διαφορετικά προγράμματα συνερμολόγησης, βλέπετε εδώ πέρα ποια ήταν αυτά τα προγράμματα, και δώστε μας τα αποτελέσματα της συνερμολόγησης στο ίδιο ακριβώς γονιδίωμα να κάνουμε μετά σύγκριση ποιο είναι αυτό το οποίο δουλεύει καλύτερα. Όποιο πιστεύεις εσύ, ο καθένας θα χρησιμοποιεί διαφορετικό πρόγραμμα συνερμολόγησης να μπορέσουμε να συγκρίνουμε. Και βλέπετε μια αξιολόγηση αυτών των προγραμμάτων με διάφορους παραμέτρους, που δεν έχουν σημασία οι παράμετροι, βλέπετε ότι υπάρχει πολύ διακύμανση όσον αφορά τα αποτελέσματα του κάθε προγράμματος, και αυτό που καταλήγουνε οι ερευνητές και η εργασία αυτή είναι ότι ακόμα υπάρχει πολύ μεγάλο περιθώριο βελτίωσης σε όλες αυτές τις πλειοπληροφορικές προσεγγίσεις, ότι τελικά να παίρνουμε ένα καλό αποτέλεσμα. Είναι πάρα πολύ σημαντικό να καταλάβετε ότι, ναι, έχω την αλληλουχία, εκατομμύρια αλληλουχίες, αλλά το δύσκολο είναι να πάρω το σωστό αποτέλεσμα, γιατί με τόσο εκατομμύριο αλληλουχίες μπορώ να πάρω και εκατομμύρια αποτελέσματα συναρμολόγησης, ανάλυσης ή οτιδήποτε. Όσο περισσότερο το ψάξω, όσο περισσότερο προγράμματα διαφορετικά δουλέψω, τόσο και καλύτερα αποτελέσματα θα πάρω, αλλά ποτέ δεν θα πάρετε ένα αποτέλεσμα. Θα πάρετε πολλά διαφορετικά αποτελέσματα και εκεί θα πρέπει να υπάρχει πάντα και αμφιβολία πώς σωστό είναι το αποτέλεσμά μου, μήπως έκανα κάποιο λάθος στη βιοπληροφορική προσέγγιση, μήπως πρέπει να το προσέξω, να το προσεγγίσω και αλλιώς. Είναι δύσκολη αυτή η διαδικασία. Παρένθεση, μιλώντας για προγράμματα και συναρμολόγηση και τα λοιπά, νομίζω αυτή την εβδομάδα βγήκε και στο Science τα αποτελέσματα από την αλληλούχηση των γονιδιωμάτων σε ένα εκπρόσωπο από τις 36 διαφορετικές τάξεις στα πουλιά και στα ερπετά. Έχει πάρα πολλή προφορία εκεί μέσα, μιλάει για τα μονοπάτια τα γονιδιωκά που έχουν να κάνουν με το τραγούδι των πουλιών, με το κελάιδισμα και πώς υπάρχουν εκεί πέρα αντίστοιχα γονίδια που υπάρχουν και στα δικά μας τα μονοπάτια που έχουν να κάνουν με την εκφορά της φωνής. Μιλάει για την εξέλιξη των χρωμοσομάτων σε πουλιά και πώς έχει μεταβληθεί το γονιδιωμά τους στη διάρκεια των χρόνων. Έχει, νομίζω, βγήκανε καμιά σαρανταριά εργασίες ταυτόχρονα από comparative genomics σε πουλιά και σε σχέση με όλα τα υπόλοιπα, όχι μόνο στο Science αλλά και σε άλλα περιοδικά. Έχει πάρα πολλή προφορία, άμα έχετε όρεξη να διαβάσετε μέσα στα Χριστούγεννα μπορείτε να βρείτε. Αυτό αφήστε το, δεν μας ενδιαφέρει αυτή τη στιγμή. Και το μεγάλο θέμα, μην ξεχνάτε, είναι ότι σκεφτείτε ότι όλα αυτά ξεκινάνε και τελειώνουν στον άνθρωπο ως επιτοπλίστων. Όλη η φασαρία που γίνεται, γίνεται βασικά για να μπορέσουμε να πάρουμε αποτελέσματα τα οποία θα μπορέσουμε να χρησιμοποιήσουμε ως επιτοπλίστων τα νοσοκομεία για να μας δώσουν κάποια πληροφορία που έχει ενδιαφέρον για τον άνθρωπο. Και σας υπενθυμίζω τη συζήτηση που είχαμε κάποια στιγμή πριν από ένα μήνα για τη μεγάλη φασαρία που είχε γίνει σχετικά με τα δεδομένα που είχαν βγει από αλληλουχήσεις γονιδιωμάτων που βγήκαν στο διαδίκτυο και μετά κάποιος ερευνητής βρήκε ποιον ήταν το γονιδίό μας σε κάθε περίπτωση. Έτσι λοιπόν αρχίζουν και βγαίνουν μηχανήματα όπως της Knome, το Knosis 100 το οποίο είναι ένα σύστημα που είναι πλήρες σύστημα παραγωγής, ανάλυσης αλλά και αποθήκευσης δεδομένων άρα τα πάντα το αγοράζω εγώ σαν νοσοκομεία αυτό το μηχάνημα, ό,τι αποτελέσματα πάρω θα μείνουν αποκλειστικά και μόνο σε εμένα. Θα μπορώ να λέω στους ασθενείς μου ότι κανείς δεν πρόκειται να τα μάθει αυτά τα αποτελέσματα να τα ξέρω μόνο εγώ για εσάς. Το μηχάνημα αυτό δεν το λες φθινό αλλά ούτε και ακριβό σε σχέση με την ηλούμινα οπότε σκοπός βεβαίως όλων αυτών των μηχανημάτων είναι να υπάρχει ασφάλεια και απόρρητο πληροφοριών αλλά να μπορεί και τι να σου κάνει, να σου επεξεργάζεται την πληροφορία και να σου δίνει αυτή την πληροφορία η οποία είναι σημαντική και από γιατρικής απόψης ώστε να σου αναλύει κατά κάποιο τρόπο με έτοιμα software τα αποτελέσματα και να σου ψάχνει αυτές οι μεταλλάξεις που μπορεί να έχουν κάνει για τον καρκίνο, για τις οποίεςδήποτε κλειονομικές ασθένειες, ό,τι θέλεις. Και νομίζω, ναι, να δω λίγο. Α, έχουμε χρόνο ακόμα, νομίζω ότι πέρασε ο χρόνος. Για σκεφτείτε λίγο εδώ πέρα, να αρχίσουμε να σκεφτόμαστε λίγο κι εσείς. Να δούμε διαφορετικούς τρόπους που θα χρησιμοποιούσατε εσείς, τι μηχανήματα θα χρησιμοποιούσατε, ποια τεχνική και τι μηχανήματα, άμα θέλετε να λουχίσετε το γονιδίό μας σε ένα πρωτεύον, το γονιδίό μας σε ένα κουνούπι ή το γονιδίο με νόσο βακτηρίου. Σκεφτείτε με όλα αυτά που είπαμε, ας πούμε, εσείς τι θα προτιμούσατε. Σκεφτείτε το και το συζητάμε. Θέλετε να χρησιμοποιήσετε μηχανήματα Ιλούμινα, θέλετε να χρησιμοποιήσετε μηχανήματα, θέλετε να κάνετε χαρτογράφηση εξ αρχής, θέλετε να χρησιμοποιήσετε μηχανήματα 454, Pacific Biosciences, δεν υπάρχει μια απάντηση σε αυτό, δεν υπάρχει μια μόνο σωστή απάντηση. Θέλω να μου πείτε τη δικιά σας την προσέγγιση και γιατί πιστεύετε ότι με βάση αυτό που ζητάτε, χρειάζεται να έχω υπόψη μου αυτό, άρα λοιπόν κατά λίγο να χρησιμοποιήσω αυτό το μηχάνημα. Σκεφτείτε το λίγο. Εντάξει, με μπερδεύεις λίγο, τώρα δεν θέλουμε στην πραγματικότητα, εφόσον θέλουμε να κάνουμε σύγκριση του ενός αγώνιδιώματος με το άλλο και να δούμε εξέλιξη, δεν θέλουμε να χρησιμοποιήσουμε σαν πρότυπο τον άνθρωπο, γιατί τότε μπορεί να μπερδευτούμε πώς θέλουμε να συγκρίνουμε κάτι με κάτι άλλο και να είναι ανεξάρτητα το ένα με το άλλο. Αν το χρησιμοποιείς το αγώνιδιώμα του ανθρώπου, τότε δεν είναι ανεξάρτητα σε δύο συγκρίσεις. Αρχικά το ξεκίνησες καλά, μετά μπερδεψες με αυτό που είπες ότι θες να το κάνουμε. Θα μπορούσαμε να ξεκινήσουμε όντως με το 1.454 μηχάνημα για να κάνουμε συναρμολόγηση, γιατί θέλουμε μεγάλα διαβάσματα. Τι άλλο θα μπορούσαμε να κάνουμε? Θα μπορούσαμε ίσως να κάνουμε και χαρτογράφηση, να χρησιμοποιήσουμε και χαρτογράφηση, δηλαδή να κάνουμε και ιραρχική προσέγγιση, όχι μόνο whole genome sequencing, να κάνουμε και μια ιραρχική προσέγγιση. Γιατί εκεί πέρα, εφόσον μιλάμε για ευκαιρωτικό γωνιδίωμα, θα έχουμε προβλήματα σε συναρμολόγηση. Και τα προβλήματα της συναρμολόγησης, στις περισσότερες περιπτώσεις, δεν μπορείς να τα λυσμώνω, ειδικά για ευκαιρωτικά γωνιδιώματα, με ένα next generation sequencing μηχάνημα. Και με full whole genome sequencing, shotgun sequencing. Θες και λίγο ιραρχική προσέγγιση, να κάνεις και κάποιους χάρτες. Οπότε να πας σε χρωμοσώματα, να τα βάλεις σε μπάξη, να κάνεις μια χαρτογράφηση εκεί πέρα, να βρεις τι γίνεται εκεί πέρα και μετά να κάνεις τη σύγκριση με το γωνιδίωμα του ανθρώπου. Εγώ δηλαδή θα προτιμούσαμε, αν θέλαμε να κάνουμε σωστή δουλειά, να χρησιμοποιήσουμε και ιραρχημένη προσέγγιση, και whole genome sequencing, αλλά με ένα μηχάνημα, το οποίο διαβάζει με γάλαδια κομμάτια. Στο qunop, τι μπορούμε να κάνουμε? Στο qunop, βασικά, σκεφτείτε το στόχο μας, ποιος είναι ο στόχος μας εδώ πέρα. Το qunop βέβαια, οι γνώσεις είναι στοχευμένα αποκλειστικά και μόνο στο να αναλύγουν ιδιώματα από άνθρωπο. Δηλαδή εκεί πέρα, ό,τι και να βάλεις, θα σου το πάρει με σύγκριση με τον άνθρωπο και θα σου διαβάζει μόνο γοντιώματα ανθρώπου. Δεν μπορείς να χρησιμοποιήσεις ένα τέτοιο μηχάνημα. Εκεί είναι μόνο συναρμολώσεις, όλα τους τα μοντέλα, όλα τα βιοπληροφορικά σου τα προγράμματα, στόχος τους είναι ο άνθρωπος. Οτιδήποτε άλλο να του βάλεις εκεί πέρα, δεν θα μπορέσει να το αναλύσεις καλά. Δεν θα σου δώσεις καλά αποτελέσματα. Αλλά να δούμε λίγο ποιος είναι ο στόχος μας σε αυτή την περίπτωση. Ελονωσία. Τι μας ενδιαφέρει εδώ, δηλαδή περισσότερο. Μας ενδιαφέρουν οι παραλαμβανόμενες περιοχές. Όχι. Τι μας ενδιαφέρουν. Μας ενδιαφέρουν γονίδια βασικά ως απετοπλίστων. Μας ενδιαφέρουν να πάρουμε πληροφορία και άμα κάνουμε λάθος στη συναρμολόγηση και έχουμε και κόντιγκς, τα οποία δεν πάνε και καλά και δεν συναιθούνε και καλά και έχουμε και λάθη ιδιαίτερα στη συναρμολόγηση. Μας ενδιαφέρουν και οι παραλαμβανόμενες περιοχές. Όχι ιδιαίτερα. Ο στόχος μας είναι να βρούμε τα γονίδια και πώς δουλεύουν τα γονίδια. Άρα και άμα δεν χρησιμοποιήσουμε και μηχανήματα, δεν χρησιμοποιήσουμε η αρχημένη προσέγγιση για να κάνουμε χάρτες. Χάνουμε κάτι. Μας ενδιαφέρει τόσο πολύ. Όχι. Μας ενδιαφέρει κυρίως να βρούμε τα γονίδια που τα γονίδια είναι μοναδικές περιοχές. Στις μοναδικές περιοχές όμως θέλουμε να έχουμε καλό διάβασμα. Άρα το πιο καλό θα ήταν να χρησιμοποιήσουμε λούμινα ή κάτι τέτοιο που ναι μεν δεν θα μπορέσουμε να κάνουμε ένα τέλειο γονιδίωμα απόλυτα συναρμολογημένο κτλ. αλλά who cares στο κάτω κάτω. Η αρχημένη δεν χρειάζεται πάρα πολύ. Η αρχημένη θα τη χρησιμοποιήσεις ιδιαίτερα άμα έχεις προβλήματα με πανελαμβανόμενο DNA και θέλεις να κάνεις μια χαρτογράφηση από πιο πριν. Το ίδιο αποτέλεσμα θα μπορέσει να πάρεις και με whole genome approach. Δηλαδή η αρχημένη τη χρειάζεται συνήθως όταν έχεις πολλά χρωμασώματα, πολύ πανελαμβανόμενο DNA το οποίο θα σε μπερδέψει στην αρμολόγηση. Τα βακτήρια δεν έχουν τόσο μεγάλο πρόβλημα. Δηλαδή η αρχημένη προσέγγιση είναι πολυτέλεια δεν το χρειάζεσαι. Θέλεις μια whole genome approach. Η λούμινα φθινά και γρήγορα και στην αρμολόγηση θα την μπορέσεις να την καταφέρεις. Άμα θέλουμε βέβαια να το κάνουμε λίγο πιο πολύπλοκο μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε και αυτή την εργασία που είπαμε μόλις τώρα και να πούμε ανάλαμβε το πόσο πολυπλοκότητα έχει να διαλέξουμε και τι μηχάνημα θέλουμε. Γιατί για αυτά ήταν όλα βακτήρια. Για απλή πολυπλοκότητα μια χαρά μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε μηχάνημα η λούμινα μόνο. Για πιο δύσκολα, ίσως να χρησιμοποιήσουμε και μηχανήματα που διαβάζουν ακόμα μεγαλύτερα κομμάτια. 454, Pacific Biosciences και ούτω καθεξής. Και ένα τελευταίο, εδώ, για να το κάνουμε ακόμα λίγο πιο πολύπλοκο. Έστω ότι έχουμε και ένα φυτό, που τα φυτά γενικά είναι πολυπλοειδή, ειδικά, ας πούμε, η εμπορική φρεόλου είναι 8 πλοειδές. Το ζεχαρότευτο είναι 12 πλοειδές. Εδώ τι τεχνική θα πρέπει να χρησιμοποιήσετε? Τι προσέγγιση? Τι σημαίνει πολλαπλοειδές και 12 πλοειδές ή οτιδήποτε και 8 πλοειδές. Τι περιμένετε, ναι? Και όχι μόνο οι επαναλήψεις. Θα έχουμε και πάρα πολλές περιοχές, οι οποίες θα μοιάζουν πάρα πολύ μεταξύ τους. Οι χωρίς δεν είναι επαναλαμβανόμενοι σε αυτή τη στιγμή. Και τα γονίδια θα μοιάζουν πάρα πολύ μεταξύ τους. Δηλαδή, εδώ μιλάμε για δύσκολη συναρμολόγηση, πολύ δύσκολη. Ναι, γιατί σκέψτε ότι όταν έχεις 8 πλοειδές γονιδί, μας σημαίνει ότι το ίδιο γονίδιο πάνω κάτω θα το βρεις 8 φορές στον διπλοειδές σου πυρήνα. Άρα 16 φορές θα το βρεις αυτό το γονίδιο. Άντε πες ότι παίρνεις το πλοειδές το 8 φορές στο 1, ο γονίδις το 12 φορές. Και εκεί πέρα θα διαβάζεις αλληλουχίες και τι θα κάνεις εκεί πέρα, θα λες βλέπω μια αλληλουχία και ένα άλλο μικρό κομμάτι πιο πέρα. Τώρα ανήκει στο πρώτο αντίγραφο, στο δεύτερο, στο τρίτο, στο τέταρτο, στο πέμπτο, σε ποιο. Άρα εδώ τι θα μπορούσατε να κάνετε, τι θα προτείνατε αν είχατε τα χρήματα. Μεγάλα κομμάτια και τι άλλο. Και ηραρχημένη προσέγγιση και ο συνδυασμός Pacific Biosciences με ηραρχημένη προσέγγιση, να κάνεις και κάποιους χάρτες, να ξέρεις λίγο τι γίνεται εκεί πέρα. Να ξέρεις τουλάχιστον ότι εγώ αυτή τη στιγμή δουλεύω με το χρωμόσωμα 1. Εγώ δουλεύω με το χρωμόσωμα 2. Δεν δουλεύω μόνο μαζί το γωνιδίωμα. Κάνω μια ηραρχήση των μπακ μου, ξέρω ποιο μπακ αντιστοιχεί σε ποιο χρωμόσωμα και το προσεγγίζω έτσι. Αυτό είναι το πιο δύσκολο από όλα. Αυτό είναι από τα πιο δύσκολα για να μπορέσεις να φτάσεις τελικά να έχεις ένα καλό γωνιδίωμα εδώ πέρα. Θέλεις πολλή δουλειά. Γιατί έχεις και το επαναλαμβανόμενο τι είναι αυτό καθ' αυτό που υπάρχει σε ευκαιρωτικούς οργανισμούς και όλο το πρόβλημα από το γεγονός ότι είναι πολύ πλοϊδές στο φυτό μου. Εντάξει, νομίζω. Όχι, όχι, έχουμε λίγο ακόμα, στα γρήγορα, δύο ακόμα διαφάνειες. Λοιπόν, μιλήσαμε πάρα πολύ για γωνιδιώματα, για λούχηση γωνιδιωμάτων και από εκεί που είμαστε λοιπόν στο γωνιδίωμα των πολλών κυτάρων, να δούμε και νέες τεχνικές οι οποίες πια βασίζονται στην αλληλούχηση του γωνιδιώματος του ενός κυτάρου. Ξεκινήσαμε, είχαμε το DNA μας, το οποίο το DNA μας από πολλά κύτταρα το ενισχύαμε πολλές φορές και μετά το διαβάζαμε. Τώρα, μετά πήγαμε στα μηχανήματα λούχησης τρίτης γενιάς που είχαμε το DNA που πέραμε από ένα κύτταρο, αλλά το μοναδικό DNA που δεν πέραμε από ένα κύτταρο, μπορούσαμε να το πάρουμε από διαφορετικά κύτταρα και να το διαβάσουμε αυτό το DNA. Και τώρα φτάνουμε στην ικανότητα να πάρουμε ένα κύτταρο όλο και όλο και να διαβάσουμε το ένα αμόριο DNA από το ένα κύτταρο. Στα μηχανήματα τρίτης γενιάς είχαμε το ένα DNA από πολλά κύτταρα. Τώρα, λοιπόν, μπορούμε να διαβάσουμε και το ένα DNA από το ένα κύτταρο με μια τεχνική η οποία λέγεται Malback, η οποία βασικά ενισχύει με κάποιο τρόπο πολλές φορές το DNA του ενός κυτάρου και μετά μπορούμε να το βάλουμε να το διαβάσουμε. Μετά γίνεται κανονική sequencing με ό,τι μηχάνημα θέλετε. Τι μπορούμε να πάρουμε από αυτό, τι πληροφορίες μπορούμε να πάρουμε. Μπορούμε να πάρουμε, ας πούμε, μεταλλάξεις που μπορούν να γίνονται σε καρκινικά κύτταρα ή ακόμα και να πας, ας πούμε, στο σπερματοζωάριο ή στο άριο ενός ατόμου και να καθίσεις και να συγκρίνεις τι ανασυνδυασμοί έχουν γίνει στο κάθε σπερματοζωάριο ξεχωριστά σε σχέση με τα πατρικά και τα μητρικά τα χρωμοσώματα. Βλέπετε εδώ πέρα, ας πούμε, ότι έχουν κάνει ανάλυση σε κύτταρα ξεχωριστά σπερματοζωάρια οπότε να μπορείς να προβλέψεις σε κάθε περίπτωση ποιο ήταν το πατρικό ή το μητρικό το απλότυπος. Λάθος, αυτό πρέπει να είναι... αυτό πρέπει να το δω... Όχι, αυτό μπορεί να είναι και ένα οάριο όλο και όλο που έχουμε πάρει και μπορείς να δεις ανασυνδυασμούς εκεί πέρα. Όχι, σπερματοζωάριο που μπορείς να δεις στο συγκεκριμένο το άτομο τι έχει προκύψει, ποια χρωμοσώματα έχουν ανασυνδυαστεί για να πάρεις το συγκεκριμένο το γωνιδίωμα. Και πέρα από αυτό, αυτό που χρησιμοποιούν σαν μια παραλλαγή παρόμοια αλλά και διαφορετική τεχνική ταυτόχρονα είναι... υπάρχει πάλι μια άλλη προσέγγιση, νιουξέκ, η οποία πάλι λουχεί γωνιδιώματα ολόκληρα, πάλι από μοναδικά κύταρα, αλλά παίρνει κύταρα από καρκινικά κύταρα, τα οποία είναι έτοιμα να διπλασιαστούν, οπότε ήδη έχει διπλασιαστεί το γενετικό τους υλικό αυτό καθαυτό, οπότε εκείνη τη στιγμή τα απομονώνεις, άρα έχουν μια διπλάσια ποσότητα γενετικού υλικού και πάνω σε αυτά μπορείς να δουλέψεις και να διαβάσεις ποιο είναι το γωνιδιώμά τους, οπότε έχεις περισσότερο γενετικό υλικό από το οποίο να ξεκινήσεις, οπότε έχεις λιγότερα λάθη στην αλληλούχηση και με βάση αυτή τη λογική ας πούμε βδείτε, κάνανε αναλύσεις σε μεμονωμένα κύταρα και ψάξανε να βρούνε τις μεταλλάξεις που συμβαίνουν σε μεμονωμένα κύταρα καρκινικά και βλέπετε ότι βρήκαν ένα ποσοστό που είναι οι κλονικές μεταλλάξεις που προκύπτουν από ένα αρχικό κύτερο και βλέπετε και πόσο μεγάλος είναι ο αριθμός των τενόβο μεταλλάξεων. Απλώς λίγο να δούμε πού βρισκόμαστε, πολύ γρήγορες ανεφαρμογές. Όλα αυτά και τα πού βρισκόμαστε αυτή τη στιγμή υπάρχουν σε μια εργασία την οποία θα στη βάλω και στο Moodle, που βγήκε φέτος 2014 που συζητάει πού βρισκόμαστε αυτή τη στιγμή όσον αφορά το sequencing. Καμιά ερώτηση, ναι. Σε αυτό, σε αυτό? Ναι, λέει εδώ πέρα ότι παλιά ας πούμε έπαιρες το ολόκληρο το γωνιδίωμα, το έκανες ολόκληρο ενίσχυση και μετά το διάβαζες. Τώρα από μια ομάδα κυτάρων παίρνεις ένα κύτερο και κάνεις αλληλούχιση ενίσχυση του DNA του ενός κυτάρου. Χρειάζεται απαραίτητος εδώ πέρα ακόμα να το κάνεις ενίσχυση, ναι. OK.