| Στόχοι Μελέτης, DNA – Ο φορέας της γενετικής πληροφορίας, Προβλήματα στην αλληλούχιση και μέθοδοι αντιμετώπισης τους, Χρωμοσωμικοί, Γενετικοί, Φυσικοί χάρτες και Χάρτες αλληλουχίας (και Ασκήσεις), Νέα μηχανήματα αλληλούχισης, Συναρμολόγηση και αποθήκευση δεδομένων, To μέλλον των αναλύσεων, Εύρεση γονιδίων στις αλληλουχίες γονιδιωμάτων: Επίσης, συζητήσαμε, κάναμε κάποιες ασκήσεις, μην ξεχάσουμε να πούμε πώς μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε τους γενετικούς δείκτες, να τους βάλουμε σε μια σειρά, σε σχέση με τη σχετική απόσταση μεταξύ τους. Και επίσης συζητήσαμε, κάναμε κάποιες ασκήσεις, μην ξεχάσουμε να πούμε πώς μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε τους γενετικούς δείκτες, να τους βάλουμε σε μια σειρά, σε σχέση με τη σχετική απόσταση μεταξύ τους. Και επίσης συζητήσαμε, κάναμε κάποιες ασκήσεις, μιλήσαμε για SNIPS, μιλήσαμε για μικροδροφορικό DNA, οι δύο βασικοί δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν. Και μιλήσαμε ότι μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε και αυτούς τους γενετικούς δείκτες, για να μπορέσουμε να συσχετίσουμε τους γενετικούς δείκτες με μια ασθένεια, κάνοντας έλεγχο ανάλυσης σύνδεσης. Αυτή η άσκηση την οποία την ξεκινήσαμε στο προηγούμενο το μάθημα, σας δίνει τη δυνατότητα να κατευθύνετε προς αυτή την κατεύθυνση, να δείτε δηλαδή πώς χρησιμοποιούμε τους γενετικούς δείκτες για να ταυτοποιήσουμε γονίδια που σχετίζονται με κάποια ασθένεια. Έτσι λοιπόν, αυτό που σας λέει η άσκηση είναι ότι έχετε μια ασθένεια που σχετίζεται με σταδιακή τύφλωση. Ξέρουμε με προηγούμενες πληροφορίες ότι το γονίδι ότι σε δράζεται κάποιος στο χρωμόσομα 11 και υποθετικά, αν και βεβαίως σε εννιά δείκτες ποτέ δεν αρκούνε για να μπορέσει να ταυτοποιήσει τη θέση ενός γονιδίου, χρησιμοποιήθηκαν για να βρουν την ακριβή θέση αυτού του γονιδίου. Και η ερώτηση είναι λοιπόν ποιος από τις εννιά δείκτες, αυτούς τους μικροδροφορικούς δείκτες, βρίσκεται πιο κοντά στη μετάλλαξη που προκαλεί την ασθένεια. Εδώ πέρα λοιπόν έχετε, τι σημαίνει αυτό, πώς είναι αυτό. Γενναλογικά δέντρα ξέρετε, ή τέλος παντών πιστεύω ότι ξέρετε, ο πατέρας, η μητέρα, τα παιδιά τους, το κόκκινο σημαίνει βεβαίως ότι πάσχουν αυτά τα άτομα, το μπλέτο ότι δεν πάσχουν. Και βλέπετε ποιος είναι ο γεννότυπος του κάθε ατόμου. Έτσι βλέπετε, ας πούμε, ότι ο πατέρας, στο μικροδροφορικό τόπο 1, είναι τερόζυγος για τα λιλόμορφα 0 και 1. Ενώ η μάνα είναι ομόζυγη για τα λιλόμορφα 0 και 0. Και ούτω καθεξής. Πρέπει να ψάξετε να βρείτε μικροδροφορικό τόπο, ο οποίος προφανώς ένα λιλόμορφο υπάρχει στον πατέρα που πάσχει, το έχει μεταβιβάσει και στα άτομα που πάσχουν επίσης και δεν υπάρχει σε άτομα που δεν πάσχουν. Για κοιτάξτε το λίγο, έχετε 5 λεπτάκια, για να το σητήσουμε. Βλέπουμε ανάλυση σύνδεσης αυτή τη στιγμή, υποθετικά. Δηλαδή, ψάχνουμε κάποιο γενετικό δίκτυ που να είναι στενά συνδεδεμένος με το λιλόμορφο που προκαλεί τη συγκεκριμένη ασθένεια. Άρα λοιπόν αυτό που θέλουμε να βρούμε είναι αλληλόμορφα μικροδροφορικών τόπων, τα οποία όταν υπάρχουν σε ένα άτομο, είναι σαν να είναι το σύγκεκριμένο αλληλόμορφο αυτό που φέρει και την ασθένεια. Άρα λοιπόν πρέπει να δείτε εδώ πέρα αν αυτά τα αλληλόμορφα ας πούμε είναι χαρακτηριστικά για την ασθένεια. Να το πάρουμε δηλαδή. Βλέπετε για παράδειγμα, αν πάρουμε εδώ πέρα, έχουμε το μηδέν το αλληλόμορφο, βέβαιο το βρίσκουμε και σε άτομα τα οποία είναι μια χαρά στην υγεία και επίσης και άμα δούμε και τους γενοτύπους των απογόνων και εδώ πέρας πίσω αυτό το μηδέν το αλληλόμορφο, αυτό το άτομο είναι μια χαρά, άρα σίγουρα το μηδέν το αλληλόμορφο δεν συνδέεται με το αλληλόμορφο που προκαλεί την ασθένεια. Να δούμε το 1 το αλληλόμορφο που βλέπουμε ότι υπάρχει μόνο στον πατέρα που πάσχει, δεν υπάρχει στη μάνα που δεν πάσχει. Εδώ πέρα δεν το βρίσκουμε. Εδώ πέρα τι βλέπουμε ότι αυτό το άτομο πάσχει αλλά δεν έχει το αλληλόμορφο 1. Έχει το αλληλόμορφο μηδέν. Άρα σίγουρα δεν είναι ούτε το αλληλόμορφο 1 το οποίο αυτό μας ενδιαφέρει. Με αυτή τη λογική συνεχίζουμε και σε όλα τα επόμενα τα αλληλόμορφο και το τσεκάρουμε. Το καταλάβατε αυτό που είπα τώρα, ε? Συνεχίστε με το 2-0 και το 2-1, 3-1, 3-0. Τι γίνεται με αυτά τα αλληλόμορφο? Το 4-0. Θες να μας πεις γιατί το 4-0, όντως έχεις δίκιο. Υπάρχει σε όλους τους ασθενείς και σε κανένα άτομο το οποίο να... και όχι στα υγεία τα άτομα. Άμα το πάρουμε, βλέπουμε εδώ πέρα, ας πούμε, εδώ πέρα, αν πάμε στο 2 το γονιδιακό τόπο, υπάρχει το 2-0 και το 2-1 αλληλόμορφο. Το 2-1 αλληλόμορφο υπάρχει και στα άτομα τα οποία είναι μια χαρά, μάλλον δεν είναι, να το τσεκάρουμε κιόλας. Εδώ ας πούμε, να το 2-1 αλληλόμορφο δεν μπορεί να είναι αυτό το οποίο οφείλεται στην ασθένεια, στο οποίο συσχετίζεται με την ασθένεια. Το 2-0 αλληλόμορφο βλέπουμε εδώ πέρα ότι εδώ το φέρει ένα άτομο που πάσχει, αλλά εδώ πέρα το φέρει ένα άτομο το οποίο δεν πάσχει, άρα δεν μπορεί να είναι και αυτό το αλληλόμορφο. Και άμα συνεχίσουμε έτσι, βλέπουμε εδώ πέρα το αλληλόμορφο 4-0, υπάρχει στον πατέρα που πάσχει, δεν υπάρχει στη μάνα, δεν υπάρχει εδώ, δεν υπάρχει εδώ, δεν υπάρχει εδώ, δεν υπάρχει εδώ και υπάρχει εδώ και εδώ. Άρα αυτό είναι το αλληλόμορφο το οποίο ψάχνουμε. Το καταλαβαίνετε γιατί? Τι σημαίνει αυτό? Εκεί είναι λίγο αυτό που θέλω να καταλάβετε. Το αλληλόμορφο αυτό καθ' αυτό του μικροδροφωρικού τόπου δεν είναι το αλληλόμορφο το οποίο προκαλεί την ασθένεια. Είναι ένα αλληλόμορφο όμως το οποίο είναι πολύ στενά συνδεδεμένο με το γονίδιο το οποίο η μετάάλλαξη φέρει αυτή την ασθένεια γι' αυτό και μας βοηθάει να καταλάβουμε τι γίνεται. Αυτό που θέλω να θυμάστε και αυτό το οποίο το ξέρετε είναι ότι τα χρωμοσομικά τμήματα μετακινούνται σαν αυτό που λέμε σαν μπλοκς, σαν κομμάτια από μια γενιά σε άλλη. Και όσο πιο κοντά είναι δύο θέσεις στο γονιδίωμα, δύο γονίδια, δύο γενετικοί δίκτες τόσο πιο πιθανό είναι αυτά τα δύο τα κομματάκια, οι δύο ενεξάρτη γενετικοί δίκτες να μεταφερθούν μαζί σε μια επόμενη γενιά. Όσο πιο μακριά είναι υπάρχει μικρότερη πιθανότητα γιατί θα γίνει ένα συνδυασμός μεταξύ τους. Δύο πολύ κοντινοί δίκτες, επειδή είναι σε απόλυτη σύνδυση μεταξύ τους, θα μετακινούνται στην επόμενη γενιά σαν κομμάτια, σαν μπλοκς, έτσι χρησιμοποιείται η αγγλική ορολογία. Και τι μας λέει αυτό, γιατί σας το λέω αυτό και τι είναι σημαντικό. Το αλληλόμορφο αυτό το μηδέν σίγουρα δεν προκαλεί την ασθένεια, αλλά τι γίνεται, τι μας λέει αυτό. Σκεφτείτε ότι πριν από κάποια χιλιάδες εκατομμύρια χρόνια, δεν ξέρω τι, χιλιάδες χρόνια, έγινε μια μετάλλαξη η οποία έγινε σε εκείνο το χρωμοσωμικό κομμάτι, σε εκείνο το γονίδιο, το οποίο προκαλεί την ασθένεια. Κοντά σε αυτή τη μετάλλαξη υπήρχε προφανώς αυτό το αλληλόμορφο, το οποίο δεν είναι αυτό που καθορίζει την ασθένεια, απλώς επειδή είναι σε πάρα πολύ στενή σύνδεση με αυτή τη μετάλλαξη, το οποίο προκαλεί την ασθένεια, γι' αυτό κληρονομείται στα επόμενα άτομα, μαζί σ' αυτά τα άτομα, γι' αυτό είναι δείκτης της ασθένειας. Το καταλαβαίνετε αυτό. Δηλαδή, το ομικοδροφορικός τόπος δεν θα μας δείξει την ασθένεια, αλλά θα μας δείξει το αλληλόμορφο που δημιουργήθηκε εκεί και συγκληρονομούνται μαζί στις επόμενες γενιές. Έτσι χρησιμοποιείτε και βέβαια δεν αρκούν μόνο εννιά τόπι για να μας βρουν τη σχετική θέση των γονιδίων, θέλουμε εκατοντάδες τόπους και πάλι μπορεί να μην μπορέσουμε να βρούμε γονίδια τα οποία συσχετίζονται με ασθένεια. Γιατί? Γιατί μπορεί, εδώ σας θέλω λίγο να σκεφτείτε, είναι μια δύσκολη ερώτηση αυτή, γιατί πάλι ακόμα κι αν μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε εκατοντάδες μικροδροφορικούς τόπους γενετικούς δίκτες κάνοντας ανάλυσης σύνδεσης μπορεί τελικά πάλι να μην βρούμε γονίδια τα οποία προκαλούν ασθένειες. Εδώ πάμε στα χωράφια της γενετικής ανθρώπου, αλλά θα το δούμε κι άλλες φορές και είναι σημαντικό να το καταλάβετε και θα μιλήσουμε γι' αυτό και κάποιες φορές και στα μαθήματα. Παναγιώτης. Καλά το πας για ανάπτυξη έτω, υπάρχει περίπτωση, υπάρχει άλλο γονίδι που πισκιάζει αυτή τη μετάλλαξη. Ναι, αλλά πες λίγο κάτι παραπάνω, πώς το εννοείς. Θέλει κάποιος να αναπτύξει αυτό που λέει ο Παναγιώτης, πώς το εννοούμε. Κάπως καλά το πας, όχι ακριβώς σωστά, αλλά ναι, το μικρό σου. Αλλ' επιδράση γονιδίων επίσταση. Μπορεί να φταίνει κι άλλα γονίδια. Πιο απλά πέστε το, μην ψάξεις επίσταση, πιο απλά. Ναι, το μικρό σου. Ανά. Αυτό είναι ο πιο απλός τρόπος που μπορούμε να το πούμε. Ότι στον τελικό φαινότυπο συμβάλλουν πολλά διαφορετικά γονίδια και εδώ είναι το μυστικό που δεν είναι καθόλου μυστικό. Το κάθε γονίδιο συμμετέχει από λίγο. Εντάξει. Άρα λοιπόν επειδή ακριβώς είναι μικρό η συμβολή του κάθε γονιδίου στον τελικό φαινότυπο, είναι πολύ δύσκολο να βρεις τελικά σε μια οικογένεια ποιο από τα γονίδια είναι αυτό το οποίο συμβάλλει στον τελικό φαινότυπο. Για αυτό και δεν ξέρω αν ήδη το είπαμε για genome wide association studies όπου κάνεις αναλύσεις με χιλιάδες σε εκατοντάδες δείκτες σε χιλιάδες σε εκατοντάδες άτομα για να μπορέσεις τελικά να έχεις στατιστική ικανότητα να ανακαλύψεις το τι γίνεται εκεί πέρα. Άρα λοιπόν ένας λόγος που είπαμε είναι ότι υπάρχουν πολλά γονίδια που συμβάλλουν στον τελικό φαινότυπο και ώστε να μπορείς να το βρεις και ο άλλος ο λόγος που σχεδόν το είπα ότι με εκατοντάδες δείκτες μπορεί να μην βρεις το τελικό αποτέλεσμα γιατί δεν βρίσκεις τελικά κάποιον δίκτη ο οποίος να είναι στενά συνδεδεμένος στο γονίδι που σε ενδιαφέρει. Γιατί χρειάζεται χιλιάδες εκατοντάδες δείκτες να μπορείς να σκανάρεις, μάλλον όχι χιλιάδες δείκτες, δηλαδή αυτή τη στιγμή ας πούμε τα SNP chips που υπάρχουν υπάρχουν ένα εκατομμύριο SNP να σκανάρεις σε όλο το γονιδίό μου, όχι για εκατοντάδες δείκτες, μιλάμε εκατομμύριο δείκτες που χρειάζεσαι. Άρα λοιπόν θέλεις πολύ καλύτερη διακριτική ικανότητα για να μπορέσεις να το βρεις αυτό και πάλι μπορεί και να μην το βρεις. Εντάξει με αυτό, αυτό ήταν μια πρώτη προσπάθεια να δείτε τι σημαίνει ανάλυση σύνδεσης, ώστε να μπορούμε να βρούμε διάφορες ασθένειες. Με αυτή την άσκηση κλείνουμε το κομμάτι γενετικοί χάρτες και προχωράμε στο επόμενο κομμάτι. Και το επόμενο κομμάτι που χρειάζεται να συζητήσουμε είναι οι φυσικοί χάρτες. Στη θεωρία λοιπόν μπαίνουμε για τους φυσικούς χάρτες όπου αυτό που χρειάζεται να κάνουμε στους φυσικούς χάρτες είναι να βάλουμε σε μια σειρά τα κομματάκια μας. Σκεφτείτε ότι σας επαναφέρω στην λογική του φτιάχνω ένα γωνιδίωμα. Όπως είπαμε το γωνιδίωμά μας για να το φτιάξουμε πρώτα απ' όλα να το σπάσουμε σε μικρά κομματάκια και μετά να τα βάλουμε σε μια σειρά. Τα κομματάκια μας είναι τα κομμάτια του πάζλ και αυτά τα κομμάτια του πάζλ θα πρέπει να τα ενώσουμε μεταξύ τους για να πάρουμε το τελικό αποτέλεσμα. Να πάρουμε την όμορφη εικόνα μας που η όμορφη εικόνα μας θα είναι το συνολικό γωνιδίωμά μας. Τώρα, όπως έχουμε πει, όταν κάνεις μια βιβλιοθήκη χρειάζεται το γωνιδίωμά σου να σπάσεις σε πολλά κομμάτια που είναι και αλληλεπικαλυπτόμενα. Είπαμε ότι είναι λέξη κλειδί όσον αφορά την αλληλεπικαλυπτόμενα. Άρα λοιπόν, όπως έχεις αυτούς τους διαφορετικούς κλόνους πρέπει αυτούς τους κλόνους να προσπαθείς να τους ενώσεις και μετά να τους διαβάσεις. Έλα μου, ντε, που παίχεις για το κάθε περιοχείο του γωνιδιώματος, έχεις πολλούς κλόνους. Άρα λοιπόν, έχεις πολλές πιθανότητες να έχεις πολλά κομμάτια τα οποία είναι το ένα κάτω από το άλλο. Και χρειάζεται τελικά να προσπαθήσεις να μην διαβάζεις τυχαία από εδώ και από εκεί, αλλά να κάνεις και λίγο οικονομία. Και η φυσική χαρτογράφηση εκεί πέρα μας βοηθάει. Στο ότι κάνουμε μία οικονομία, γιατί τελικά επιλέγουμε ώστε να τόν λιγότερα κομμάτια, ώστε να τόν λιγότερους κλόνους, οι οποίοι θα μας βοηθήσουν να διαβάσουμε κατά μήκος των χρωμοσομάτων. Θα το δούμε και στην πράξη τι εννοούμε με αυτό. Οι φυσικοί χάρτες προσπαθούν να ενώσουν αλληλοπεκαλυπτόμενα τέματα DNA, τα οποία αυτά τα τέματα τα έχουμε βάλει μέσα σε βιβλιοθήκες, έτσι ώστε να έχουν μια συγκεκριμένη κατεύθυνση πάνω στα χρωμοσώματα και να ξέρουμε, ελπίζουμε, και την θέση αυτών των τμήματων πάνω στα χρωμοσώματα. Έτσι λοιπόν θα μπορέσουμε να βρούμε την ακριβή θέση αυτών των τμήματων πάνω στα χρωμοσώματα, την ακριβή απόσταση των γενετικών δικτών πάνω στα χρωμοσώματα και θα μπορέσουμε να συσκετήσουμε φυσικό χάρτη με γενετικό χάρτη. Υποθετικά στον άνθρωπο, τέλος πάντων, η αντιστοιχεία είναι 1 σεντιμόργαν 1 εκατομμύριο βάσεις, ενώ στο μποντίκι 1 σεντιμόργαν είναι 2 εκατομμύριο βάσεις. Να δούμε λίγο, για παράδειγμα, τι χρειάζεται να το κάνουμε αυτό. Εδώ βλέπετε το αποτέλεσμα, όταν έγινε η δημιουργία και του φυσικού χάρτη στη ζύμη, βλέπετε και το χρωμό σώμα 3. Βλέπετε ποια ήταν η πραγματική απόσταση των διαφόρων δικτών στο φυσικό χάρτη και ποια ήταν η απόσταση με βάση στο γενετικό χάρτη. Τι παρατηρείτε? Παρατηρείτε ότι δεν είναι ακριβώς ίδιοι. Παρατηρείτε ότι υπάρχουν και λάθη στο γενετικό χάρτη. Για παράδειγμα, ας πούμε, σε αυτό το γενετικό χάρτη τον είχαν φτιάξει στη ζύμη, φαινότανε ο δίκτης GLK1 να είναι πιο κοντά στην άκρη του χρωμοσώματος και μετά να είναι ο δίκτης CHA1. Ενώ τελικά όταν έκαναν τον φυσικό χάρτη, βλέπετε ότι ήταν εντελώς διαφορετική η σχετική θέση των δύο δικτών και πολύ μεγάλη η απόστασή τους. Και υπάρχουν και πολλές άλλες περιπτώσεις όπου κάποιοι τόποι τελικά φαίνονται στο φυσικό χάρτη να είναι πιο κοντά, ενώ κάποιοι άλλοι τόποι να είναι πιο μακριά. Γιατί να συμβεί αυτό το πράγμα, γιατί να υπάρχουν αυτές οι συναντιστυχίες. Αυτό δεν το ξέρουμε. Ναι, έχεις δίκιο. Αλλά και παρόλα αυτά και τι άλλο. Έχεις δίκιο σε αυτό. Γιατί επίσης υπάρχουν και περιοχές μέσα στα χρωμοσώματα που δεν είναι ο ρυθμός ανασυνδυασμού, διασκελισμού επάνω στα χρωμοσώματα, δεν είναι ίδιος κατά μήκος όλων των χρωμοσώματων. Υπάρχουν περιοχές σε οποίες έχουμε πιο συχνά διασκελισμό και σε άλλες που έχουμε λιγότερο διασκελισμό. Άρα λοιπόν σε κάποιες περιπτώσεις έχουμε αυξημένη απόσταση, ενώ σε κάποιες άλλες περιπτώσεις έχουμε μειωμένη απόσταση. Ενώ ο φυσικός χάρτης είναι φυσικός χάρτης. Οι βάσεις είναι πάντα ίδιες. Δεν υπάρχει τέτοια διαφορά. Πώς θα κάνουμε πρώτα απ' όλα τις βιβλιοθήκες. Εδώ πέρα μπαίνουμε λίγο στα κομμάτια της γενετικής μηχανικής. Δεν θα πω ιδιαίτερα να καθίσω να συζητήσω γιατί χρειαζόμαστε, τι φορείς χρειαζόμαστε, πώς γίνονται αυτές οι βιβλιοθήκες και το καθεξής. Αυτό είναι το κομμάτι της γενετικής μηχανικής. Πάντως αυτό που χρειάζεται να θυμάστε είναι το ότι όπως πέραμε το αρχικό το γονιδίωμα, αυτό που χρειαζόμαστε είναι να το σπάσουμε σε μερικά κομμάτια μεγάλα, τα οποία μετά τα βάζαμε σε κάποιους φορείς κλονοποίησης. Οι βασικοί φορείς κλονοποίησης που χρησιμοποιήθηκαν στην κατασκευή του ανθρώπινου γονιδιώματος ήταν οι δύο. Ήτανε τα Yaks ή ήτανε και τα Bucks. Yaks είναι γίσταρτι φυσικά κρόμοσομς, Bucks είναι μπακτήριαλτι φυσικά κρόμοσομς. Ποια είναι η διαφορά του ενός από το άλλο ότι τα Yaks επειδή είναι τεχνητά χρωμοσόματα ζήμης έχουν την ικανότητα να δεχθούν μεγάλα ενθέματα, ως ένα εκατομμύριο βάσεις, ενώ τα Bucks δέχονται μικρότερα ενθέματα, μέχρι 300.000 βάσεις, μέχρι 200.000 βάσεις και ακριβώς επειδή είναι λίγο πιο μικρά σε μέγεθος είναι και πιο σταθερά. Γι'αυτό και όλας περισσότερο χρησιμοποιήθηκαν τα Bucks. Για παράδειγμα, για να σκεφτείτε λίγο εσείς, για να ξυπνήσετε λίγο γιατί κοιμάσετε λίγο σήμερα, πόσα Bucks με μέσο μέγεθος 200.000 βάσεις χρειάζεται ώστε να μπορέσουμε να έχουμε το ανθρώπινο γονιδίωμα αποθηκευμένο σε φορείς κλεινοποίησης μια φορά. Μια απλή διέρεση είναι. Δεν σας ζητάω κάτι δύσκολο. Σκεφτείτε ότι θέλουμε να σπάσουμε το γονιδίωμα σε κομματάκια με γέθους 200.000 βάσεων και μετά να τα βάλουμε σε φορείς κλεινοποίησης. Σε Bucks σε συγκεκριμένη περίπτωση, γι' αυτό θέλουμε τέτοιο μέγεθος. Πόσα τέτοια Bucks χρειαζόμαστε να έχουμε αποθηκευμένο το γονιδίωμα. Το έχουμε πει να το μάθετε. Δύο δεν είναι. Το απλό ιδέες. Μας ενδιαφέρει. Ναι, το μικρό σου. Τι 15. 15 Bucks χρειαζόμαστε. 15 Bucks δεν χρειαζόμαστε. 15 ναι, αλλά όχι 15 μόνο. Κάτι σου λείπει, μερικά μηδενικά. 15.000 Bucks. Μακάριν ήταν μόνο 15 Bucks. Το ανθρώπινο γονιδίωμα είναι 3 δισεκατομμύρια, δια 200.000 βάσεις που θέλουμε να βάλουμε μας βγαίνουν 15.000 Bucks. Το καταλαβαίνετε όλοι. Αυτό σημαίνει ότι σπάζουμε το γονιδίωμα μας που είναι 3 δισεκατομμύρια σε κομματάκια 200.000 βάσεις. Πόσα τέτοια κομματάκια πρέπει να το σπάσουμε. Κάνουμε την απλή διέρεση και βγαίνει ότι χρειαζόμαστε 15.000 Bucks. Τι σημαίνει αυτό. Σκεφτείτε να έχετε να δουλέψετε με τον ανθρώπινο γονιδίωμα. Σημαίνει ότι έπρεπε να διαδουλέψετε με 15.000 τμήματα. Σαν να φαίνεται αρκετή δουλειά αυτό. Και αυτά τα τμήματα επίσης επαναλαμβάνω σκεφτείτε ότι δεν σας αρκούνε όπως σας έχουμε πει μια φορά μόνο να το δουλέψετε. Θέλετε κανονικά να τα διαβάσετε αυτά τα κομμάτια 10 φορές είχαμε πει. Γιατί θέλουμε να περάσουμε από την ίδια περιοχή 10 φορές. Γιατί θέλουμε να περάσουμε 10 φορές αυτή την περιοχή για να μπορούμε να καταλάβουμε ποια είναι τα λάθη και ποιος είναι ο πολυμορφισμός. Και θα δούμε λοιπόν τελικά πόσα Bucks χρειαζόμαστε στην πραγματικότητα. Με πόσα Bucks δουλεύανε οι ερευνητές όταν δουλέψανε με τον ανθρώπινο γονιδίωμα. Εδώ βλέπουμε φορείς κλωνοποίησης. Δεν μας ενέφει. Υπάρχουν διάφοροι για μεγάλα θέματα. Τα κοσμίδια, τα φοσμίδια, τα Bucks, τα Bucks, τα Yaks, αυτά θα τα συζητήσετε περισσότερο στη γενετική μηχανική, εμάς μας ενδιαφέρουν λίγο τα Bucks και τα Yaks να σας μείνουνε. Δείτε λίγο τώρα εδώ πέρα. Τις πραγματικές τιμές. Βλέπετε ότι με βάζει μια εργασία που μιλούσε για φυσικούς χάρτες. Η εργασία λέει Let's get physical. Να δούμε λοιπόν πώς θα φτιάξουμε τις φυσικούς χάρτες. Βλέπετε για το ανθρώπινο γονιδιώμα πόσο διαφορετικά Bucks χρειάστηκε να δουλέψουνε. Όχι 15.000 αλλά 283.000 Bucks. Και με αυτή τη δυνατότητα τι καταφέραν τελικά να έχουνε 15 πλάσια κάλυψη του ανθρώπινου γονιδιώματος. Στο ποντίκι βλέπω ότι... Για να σας κάνω μια ερώτηση να δούμε τι καταλαβαίνετε. Έχουμε 305.000 Bucks αλλά εδώ βλέπω ότι έχουμε διπλάσια κάλυψη. Γιατί έτσι? Διπλάσια κάλυψη σε σχέση με τον άνθρωπο. Έχουμε 33 φορές κάλυψη του γονιδιώματος. Με ελάχιστα παραπάνω Bucks έχουμε πολύ παραπάνω κάλυψη στον γονιδίμο του ποντικού. Λέτε να έχουν κάνει λάθος δεν νομίζω. Τι μπορεί να συμβαίνει εδώ πέρα. Ενώ η δροσόφυλα με λανοκάστερ με όλο και όλο... Ποιο να πω το 130 Bucks σε σχέση με τον άνθρωπο, έχουμε την ίδια κάλυψη του γονιδιώματος. Τι συμβαίνει εδώ πέρα, γιατί αυτά ήταν τελώς διαφορετικά στατιστικά. Ναι, το μικρό στον τηγόνι, ναι. Ίσως υπάρχουν πολλές κοινές αλληλουχίες μεταξύ των οργανισμών. Ίσως υπάρχουν κοινές αλληλουχίες μεταξύ των οργανισμών. Δεν είναι αυτό, όχι. Το μικρό σου. Μιχάλη. Ναι, Μιχάλη. Γιατί έχει πολύ μικρό το γονιδίωμα. Ποιος έχει πολύ μικρό το γονιδίωμα. Το ποντήκι όντως έχει μικρό το γονιδίωμα. Άρα λοιπόν σημαίνει ότι με μικρότερο γονιδίωμα... Βέβαια δεν έχει πολύ μικρότερο. Το γονιδίωμα του ποντικού είναι 2,6 δις εκατομμύρια βάσεις. Του ανθρώπου είναι 3 δις εκατομμύρια βάσεις. Αλλά όντως, εφόσον έχει μικρότερο γονιδίωμα, με λίγο περισσότερα μπάξη έχει σημαίνει να έχει πολύ καλύτερη κάλυψη. Γιατί σημαίνει ότι έχει πολύ περισσότερο αντίγραφα του γονιδιώματος. Και το άλλο που μας ενδιαφέρει και στο ποντήκι και ειδικά στη ροσόφυλα... ότι αρχικά δεν ενδιαφερόμασταν, ειδικά στα μη ανθρώπινα γονιδιώματα, να έχουμε όλο το γονιδίωμα. Ειδικά στη ροσόφυλα είχαμε εστιαστεί αποκλειστικά και μόνο στις ευχρωματινικές περιοχές. Άρα είχαμε δεκατετραπλάσια κάλυψη, όχι στο ολόκληρο το γονιδίωμα της ροσόφυλα, αλλά στις περιοχές, οι οποίες μας ενδιαφέρανε, στις ευχρωματινικές περιοχές. Το καταλάβατε? Απλώς αυτό που θέλω στο τέλος να σας μείνει είναι ότι βλέπετε την ποσότητα της δουλειάς. Είναι πάρα πολλή δουλειά να τα βάλεις αυτά σε μια σειρά και να αρχίσεις να καταλαβαίνεις τι γίνεται. Σκεφτείτε γιατί θα δούμε σε λίγο τι δουλειά χρειάζεται να κάνουμε με όλα αυτά τα μπάξη να τα βάλουμε σε μια σειρά. Σκεφτείτε πόση ποσότητα δουλειάς χρειαζότανε για να μπουν όλα αυτά σε μια σειρά. Να έχεις 300.000 κλόνους και να πρέπει να τους βάλεις σε μια σειρά. Θέλει πολλές ανθρωπόωρες. Άρα λοιπόν, έχουμε λοιπόν αυτά τα 300.000 μπάξ και θέλουμε να βρούμε τη σχετική τους θέση. Είναι σαν να έχετε 300.000 κομματάκια πάζλ και εσείς κάθεστε πάνω στο πάζλ και πρέπει να τα βάλετε το ένα δίπλα στο άλλο. Και επίσης αυτά τα κομμάκια του πάζλ μπορεί και πολλές φορές να κολλάνε το ένα πάνω στο άλλο μια χαρά και να λες καλά είμαστε, ενώ δεν είναι συμβερματικότητα καλά, ποια είναι αυτά τα κομματάκια του πάζλ που κολλάνε μια χαρά το ένα με το άλλο χωρίς να είναι σωστή η δουλειά μας. Τι κομματάκια πάζλ είναι επανανομιότυπα μεταξύ τους. Ναι, το επανανευανόμενο DNA. Στο ανθρώπινο γονιδίο έχουμε πολύ επανανευανόμενο DNA που σημαίνει ότι τα κομματάκια του πάζλ είναι όμοια μεταξύ τους. Άρα λοιπόν πώς θα το κάνουμε αυτό. Θα προσπαθήσουμε να το κάνουμε είτε με τεχνικές από πάνω προς τα κάτω είτε από κάτω προς τα πάνω. Θα το ζητήσουμε. Λίγο να σας ξαναφέρω στη γενικότερη δουλειά. Γιατί σας τα λέω αυτά τα πράγματα. Μπορεί να είναι δύσκολα, μπορεί να είναι τεχνικά παράξενα, μπορεί να είναι και λίγο βαρετά. Τι κερδίζετε σας από αυτό το πράγμα. Αρχίζετε και καταλαβαίνετε τι σημαίνει συναρμολογόγον ιδίωμα. Αρχίζετε και καταλαβαίνετε τη δυσκολία του να κάνεις αυτή τη δουλειά. Και καταλαβαίνετε την πολυπλοκότητα των γονιδιώματων. Για αυτό σας βάζω σε αυτή τη διαδικασία να τα καταλάβετε αυτά. Για αυτό είναι σημαντικό για εμένα να τα καταλάβετε. Γιατί θα μπορούσαμε να πούμε το τελικό το αποτέλεσμα ότι κάποια στιγμή φτάνουμε, έχουμε το εθνόπινο γονιδιώμα, το σπάζουμε ακόμα μετά και το σνορμαλωγούμε με υπολογιστές. Τι μάθετε από γενετική. Τίποτα. Εντάξει. Πρέπει λίγο να μπείτε στη διαδικασία του γονιδιώματος, της πολυπλοκότητας του και τι σημαίνει να αρμολογώ το γονιδίωμα. Γιατί, για να μπορέσεις ακόμα και βιοπληροφορικά να το προσεγγίσεις σε αυτό το κομμάτι, το ότι βάζω τα κομμάτια του υπολογιστή να κάνει τη δουλειά για εμένα, ο υπολογιστής θα κάνει τη δουλειά όπου θα του πεις εσύ να κάνει. Ο υπολογιστής θέλει ένα μοντέλο. Το μοντέλο για να το κάνεις, για να δουλέψεις, χρειάζεται να ξέρεις τη θεωρία. Η θεωρία είναι η πολυπλοκότητα του γονιδιώματος. Η πολυπλοκότητα του γονιδιώματος την καταλαβαίνετε μόνο μέσα από αυτή τη διαδικασία. Εντάξει. Οπότε, ναι, μένει είναι λίγο βαρετά, αλλά σας βοηθάει να καταλάβετε την πολυπλοκότητα. Γι' αυτό μπαίνουμε σε αυτή τη διαδικασία. Τώρα, και όπως είπα, οι τεχνικές είναι δύο. Είτε θα το πάμε από πάνω προς τα κάτω, είτε από κάτω προς τα πάνω. Και από κάτω προς τα πάνω θα βρούμε τρεις διαφορετικές τεχνικές. Από πάνω προς τα κάτω, θα τις δούμε τώρα πιο αναλυτικά αυτές οι τεχνικές. Θα κάνουμε είτε με υβριδισμό επάνω στον καριότυπο, ή από κάτω προς τα πάνω θα χρησιμοποιήσουμε τους γενετικούς χάρτες, ή κάποιες άλλες προσεγγίσεις. Ας τα πάρουμε σιγά σιγά. Το από πάνω προς τα κάτω τι σημαίνει? Χρησιμοποιούμε και κάνουμε ΦΙΣ. Τι σημαίνει ΦΙΣ, έχετε ακούσει ΦΙΣ, νομίζω ότι έχετε ακούσει. Κάποιος σου, ναι. Το μικρό σου. Πες Ιρακλή. Fluorescent Institute of Hybridization. Που είχατε κάνει ΦΙΣ, ποιος σας είπε? Κύριε Κουβάτσις. Στη γενετική ανθρώπου δηλαδή. Σας έχει βάλει και βιντεάκι να δείτε τίποτα. Ας βάλουμε βιντεάκι τότε. Λοιπόν, INSITU σημαίνει στη θέση. Χρησιμοποιούμε ιχνηθέτες, οι οποίοι είναι επισημασμένοι με θωρίζοντας χρωστικές. Μεταφασικά κύτερα. Τα φιξάρουμε πάνω σε κάποιον σλάιντ. Και αποδιατάσσουμε τον DNA στο αποδείκλωνο να είναι μονόκλωνο. Μετά ρίχνουμε αυτές τις περιοχές, τους κλόνους ή οτιδήποτε άλλο, τους ανοιχνευτές πάνω στα χρωμοσώματα για να ευρυδιστούν σε κατάλληλες συνθήκες. Και θα πάνε και θα κολλήσουν σε συγκεκριμένη περιοχή. Οτιδήποτε δεν κολλήσει, μετά μπορούμε να το ξεπλύνουμε. Με διάφορους τρόπους μπορούμε να βρούμε πού ακριβώς υπάρχει αυτό το σήμα. Διώχνουμε και την έξτρα χρωστική. Και μετά από εκεί και πέρα με ένα μικροσκόπι κατάλληλο μπορούμε να δούμε ακριβώς πού έχει πάει και έχει κολλήσει αυτό το τμήμα που μας ενδιαφέρει. Εδώ υποτίθεται βέβαια ότι αυτό που μας ενδιαφέρει είναι να βρούμε τη σχετική θέση ενός γωνιδίου πάνω σε χρωμοσώματα. Εμείς σκεφτείτε ότι σε μια τέτοια περίπτωση δεν θέλαμε να βρούμε ένα γωνίδιο, αλλά θέλουμε να βρούμε τη θέση των μπάκς. Τι σημαίνει αυτό, ότι έπρεπε να κάνουμε κανένα 300.000 ευρυδισμούς, κάθε ευρυδισμός με ένα κομμάτι μπάκ. Έπρεπε να κάνουμε 300.000 πυράπατα με 300.000 μπάκ, όπου σε κάθε περίπτωση χρησιμοποιούσαμε το ένθαμα από αυτό το μπάκ για να πάμε να δούμε πού κολλάει. Γιατί το κάνουμε αυτό, γιατί είχαμε σπάσει το γωνιδίό μας σε 300.000 κομματάκια, τα είχαμε περάσει σε 300.000 μπάκ και έπρεπε να ξέρουμε για το κάθε μπάκ ποια είναι η σχετική θέση πάνω σε χρωμοσώματα. Τι μας λέει αυτή η περίπτωση, είναι ότι είναι εύκολη χαρτογράφηση, δηλαδή δεν χρειάζεται πολλά πράγματα να κάνεις, απλώς αυτό το ευρυδισμό. Αλλά είναι χαμηλής ανάλυσης, γιατί βεβαίως όταν έχεις καριότυπο όλο και όλο, δηλαδή θα πάει και θα σου κολλήσει στο χρωμό σου το ένθαμα, εδώ θα σου κολλήσει, εδώ θα σου κολλήσει, εδώ θα σου κολλήσει, δηλαδή δεν μπορείς να πεις και με σιγουριά πού είναι αυτό το κόλλημα, απλώς θα ξέρεις ας πούμε ότι το συγκεκριμένο το μπακ είναι στο χρωμόσωμα 13, στο μεγάλο βραχείο, στην αρχή του, στο τέλος, κάπως έτσι. Είναι χαμηλής ανάλυσης αυτή η προσέγγιση. Αλλά μας δίνει μια ιδέα περίπου που βρισκόμαστε. Μας δίνει την ιδέα να ξέρουμε περίπου ποιους κλόνους θα δουλέψουμε για να συνεχίσουμε μετά να πάμε σε περισσότερη ανάλυση. Και πώς θα πάμε σε περισσότερη ανάλυση με τεχνικές από κάτω προς τα πάνω. Αυτή ήταν τεχνική από πάνω προς τα κάτω. Έχουμε τα χρωμόσωματά μας και πάμε από πάνω να κολλήσουμε τα μπάξ. Άρα λοιπόν τώρα θέλουμε να πάμε από κάτω προς τα πάνω με μεγαλύτερη ανάλυση και θα προσπαθήσουμε να χρησιμοποιήσουμε είτε χάρτες σύνδεσης, γενετικούς χάρτες, είτε ένδυμα περιορισμού, το οποίο κυρίως χρησιμοποιήθηκε τελικά, γιατί ήταν το πιο γρήγορο και το ας πούμε λιγότερο οικονομικά απαιτητικό και με θέση σημαίες. Αυτά είναι τα πιο δύσκολα κομμάτια που χρειάζεται να ασχοληθείτε. Στους χάρτες σύνδεσης είναι αυτός ο λόγος για τον οποίο κάναμε όλη την προηγούμενη δουλειά με τους γενετικούς χάρτες. Δηλαδή όλα τα προηγούμενα μαθήματα που μιλήσαμε γενετικούς χάρτες, ο σκοπός μας ήταν να χρησιμοποιήσουμε αυτούς τους γενετικούς χάρτες για να φτιάξουμε φυσικούς χάρτες. Στο δρόμο αλλάξανε τακτική, αλλά έτσι ξεκινήσανε. Θα δούμε γιατί αλλάξανε τακτική στο δρόμο. Τι χρειαζόμαστε? Έχουμε φτιάξει γενετικούς χάρτες. Από τη στιγμή που έχουμε φτιάξει γενετικούς χάρτες, τι ξέρουμε? Ότι έχουμε εκατοντάδες γενετικούς δίκτες που ξέρουμε τη σχετική τους θέση επάνω στα χρωμοσώματα. Και επίσης ξέρουμε και ποια είναι αυτή η θέση στους διάφορους κλόνους ή μπορούμε να το ψάξουμε να το βρούμε. Τι χρειάζεται να κάνουμε? Εμένα δεν με βολεύει αυτό, αλλά τέλος πάντων μετά θα το κάνουμε. Τι χρειαζόμαστε? Έστω λοιπόν ότι ξεκινήσαμε, έχουμε κάνει γενετικό χάρτη. Γενετικός χάρτης σημαίνει ότι έχουμε γενετικούς δίκτες και για τον καθένα από αυτό να ξέρουμε ότι αυτός βρίσκεται κοντά σε κάποιον άλλο δίκτη, σε κάποιον άλλο δίκτη κλπ. Αυτός είναι ο γενετικός χάρτης. Αυτό που χρειάζεται λοιπόν να κάνουμε και είναι πολλή δουλειά είναι ότι παίρνουμε τους δύο δίκτες μη ένα και μη δύο για τους οποίους ξέρουμε ότι από το γενετικό χάρτη είναι κοντά μεταξύ τους. Τι χρειάζεται να κάνουμε? Θα κάνουμε υβριδισμό επάνω σε όλους τους κλόνους, τους yaks ή τους bucks να βρούμε που υβριδίζονται. Και έστω λοιπόν ότι ο δίκτης 1 υβριδίζεται στον κλόνο y1 και ο δίκτης 2 υβριδίζεται στον κλόνο y2. Τι καταλαβαίνετε ή τι υποθέτετε αμέσως από αυτό? Ο δίκτης είναι μια πολύ πολύ μικρή οχή, 100-200 βάσεις. Οι κλόνοι είναι περιοχή που όπως είπαμε μπορεί να φτάνει πόσο. Τι μέγεθιση μπορεί να έχουν οι κλόνοι στα yaks? 1 εκατομμύριο βάσεις. Όταν ξέρεις ότι ο δίκτης 1 και ο δίκτης 2 είναι κοντά μεταξύ τους και αντιστοιχούν σε κάποιους κλόνους, τότε τι καταλαβαίνεις αμέσως ότι αυτοί οι δύο οι κλόνοι του 1 εκατομμύριου μεγέθους κατά πάση επιθυνόν είναι επικαλειπτόμενοι. Άρα έχεις αυτή την πληροφορία, τι χρειάζεται να κάνεις μετά να το επαληθεύσεις. Άρα λοιπόν θα πάρουμε το κλόνο y1, θα κόψουμε τα κομμάτια του και θα προσπαθήσουμε να δούμε αν υβριδίζεται επάνω στον κλόνο y2 κάπου. Αν υβριδίζεται τότε τι καταλαβαίνουμε, το τι έχουμε μια τέτοια περίπτωση. Αυτός είναι ο κλόνος y1, αυτός είναι ο κλόνος y2, υπάρχει αυτή η επικάλυψη μεταξύ τους με βάση και τους γενετικούς δείκτους μοι 1 και μοι 2. Και έτσι τι έχουμε καταφέρει για πρώτη φορά, να βάλουμε δύο κλόνους, οπότε καν ξέρουμε τη σχετική θέση μεταξύ τους ίσως, να τους βάλουμε ότι είναι επικαλειπτόμενοι. Και τώρα τι χρειάζεται να κάνουμε, να συνεχίσουν να το κάνουν αυτό ξανά και ξανά. Με αυτή τη λογική θα βρούμε, θα πάρουμε τον κλόνο τον δίκτυ 3, ο οποίος ξέρουμε με βάση το γενετικό χάρτη ότι είναι κοντά στο δίκτυ 2, θα κάνουμε υβρετισμό αυτόν του δίκτυ επάνω στους κλόνους της βιβλιοθήκης και εφόσον ξέρουμε και σε ποιους κλόνους είναι αυτός η αντιστοιχή, αυτός ο δίκτυς, θα προσπαθήσουμε να βρούμε ανεπικάλυψη του κλόνου Y2 με έναν άλλο κλόνο που θα το ονομάσουμε Y3 και ούτω καθεξής. Πολύ δουλειά. Και αυτό μας μπερδεύει και μας δυσκολεύει ακόμα περισσότερο, ότι σε κάποιες περιπτώσεις, οι κλόνοι μας τύχαινε να μην είναι επικαλειπτόμενοι. Δηλαδή μπορεί να έχεις έναν δίκτυ 4 και έναν δίκτυ 5 που να ευρυδίζονται σε κλόνους Y4, Y5, αλλά παρόλα αυτά αυτοί οι κλόνοι να είναι έτσι τοποθετημένοι που να μην είναι επικαλείπτονται. Και τι χρειαζόταν όταν είσαι με τέτοια περίπτωση, να αρχίσεις να ψάχνεις, να πάρεις κομμάτια από αυτά και να αρχίσεις να κάνεις συμβριδισμό πάλι κάτω στη βιβλιοθήκη. Ναι, έφυγε καλά, έκανες και το είπες. Άρα λοιπόν χρειαζόταν μετά να πάρουμε αυτό το κλόνο, να ψάξουμε στη βιβλιοθήκη που μπορεί να κολλάει για να βρούμε κάποιον άλλο κλόνο να μας ενώσει αυτό το γκάπ, αυτό το κενό. Δύσκολο, κουραστικό και πολύ επίπονο και πολύ χρονοβόρο και πολύ οικονομικά απαιτητικό, αλλά έτσι ξεκινήσα να το κάνουνε. Με αυτόν τον τρόπο τι θέλαμε να κάνουμε, εδώ πέρα θα ακούσετε για πρώτη φορά ένα όρο που είναι σημαντικός. Παρ' όλα αυτά αρχίσαμε σιγά σιγά να ενώνουμε τα κομματάκια μεταξύ τους. Να αρχίσουμε να βρίσκουμε κλόνους που είναι επικαλυπτόμενοι και να τους ενώνουμε σε μεγαλύτερα κομμάτια. Από το κλόνο πηγαίναμε στο συναρμολόγημα. Το συναρμολόγημα είναι το κόντιγ. Αυτό το όρο θα το βρείτε πάρα πολλές φορές. Είναι η ανώτερη οργάνωση που προκύπτει από την συνένωση αλληλεπικαλυπτόμενων κομματιών κλόνων μιας βιβλιοθήκης. Πολλές φορές θα συζητήσουμε για κόντιγς. Πολλές φορές θα πούμε πόσα κόντιγς έχει αυτό το γωνιδίωμα. Τα κόντιγς όπως βλέπετε κατά καιρούς είχαν και κενά, τα γκάπς. Με τη διαδικασία με την οποία ψάχνουμε μέσα στη βιβλιοθήκη να βρούμε κάποιον κλόνο που να ενώσει δύο διαφορετικά κόντιγς, ενώναμε κάποια κόντιγς σε μεγαλύτερα κομμάτια τα λέγαμε σκαφόλτς. Αυτό πρέπει να το γράψω. Γιατί θα το δείτε όταν θα κάνετε και τις δικές σας εργασίες. Θα βρείτε όρους κόντιγ. Θα βρείτε όρους σκαφόλτ. Και τελικά τι θέλουμε. Να ενώσουμε κομμάτια κομμάτια τα κόντιγς, τα συνερμολογήματά μας, τα σκαφόλτ και τελικά να μπορέσουμε να φτιάξουμε λόγω το γωνιδίωμα. Ποιος είναι ο σκοπός μας τελικά. Πόσα τελικά κόντιγς θα πρέπει να φτιάξουμε, αν μπορέσουμε να ενώσουμε όλους τους κλόνους μεταξύ τους εννιάς βιβλιοθήκης. Ο τελικός αριθμός, όσο περισσότερο μειώνουμε τα κενά, ενώνουμε τα συνερμολογήματα σε μεγαλύτερα κομμάτια. Αν μπορέσουμε τελικά να μειώσουμε πλήρως τα κενά, σε πόσα κόντιγς θα φτάσουμε σε ένα γωνιδίωμα του ανθρώπου ας πούμε. Πόσα. Μου απαντάτε αυτή τη ερώτηση και κάνετε διάλειμμα. Όσα και τα χρωμοσώματα. Γιατί υποθετικά κάποια στιγμή, εφόσον τελειώσουμε και μειώσουμε τα κενά, τα συνερμολογήματα θα ενωθούν και θα μαζίωσουν τα χρωμοσώματα. Εντάξει. Ειδικά αυτό το κομμάτι σχετικά με τους φυσικούς γενετικούς χάρτες και πώς τους χρησιμοποιούμε είναι δύσκολο κομμάτι και το καταλαβαίνω. Αλλά σας είπα γιατί χρειάζεται να το κάνουμε. Στα γρήγορα λίγο να το δούμε να προχωρήσουμε με αυτό το κομμάτι. Ο σκοπός μας είπαμε είναι να μπορέσεις να βάλεις τη σειρά τους γενετικούς δίκτες από τους γενετικούς χάρτες για να μπορέσουμε να κάνουμε τους φυσικούς χάρτες. Με αυτή τη λογική όπως είπαμε για να το κάνουμε μια επανάληψη είναι χρησιμοποιούμε σε αυτή την προσέγγιση την πληροφορία από τους γενετικούς χάρτες για να φτιάξουμε φυσικούς χάρτες. Τους γενετικούς χάρτες ξέρουμε ότι έχουν βάλει τους δίκτες σε μια σειρά. Ξέρουμε ότι αυτοί οι δίκτες είναι πολύ κοντά μεταξύ τους. Άρα από τη στιγμή που ξέρεις γιατί οι δίκτες είναι κοντά μεταξύ τους, αυτό που χρειάζεται να κάνεις είναι να τους υβρεδήσεις πάνω στους κλόνους που έχεις πάρει, τους εκατοντάδες χιλιάδες και να βρεις πού βρίσκεις αυτούς τους κλόνους. Το πιο σημαντικό για εσάς να καταλάβετε είναι ότι οι δίκτες είναι θέσεις 100-200 βάσεων, ενώ οι κλόνοι είναι τεράστια κομμάτια, εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων. Άρα όταν παίρνεις ένα σήμα υβρεδισμού σημαίνει ότι αυτός ο δίκτης και αυτός ο δίκτης εφόσον είναι κοντινοί υποθετικά και οι κλόνους σε οποίους έχεις δείτε ακριβώς ένα σημαδάκι είναι πάνω στον κλόνο μάλλον επικαλυπτόμενοι. Μετά χρειάζεται να ψάξεις να δεις αν όντως υπάρχει υβρεδισμός μεταξύ των άκρων αυτών των κλόνων και από τη στιγμή που βρεις αυτό τον υβρεδισμό τότε ποια είναι η τάση εδώ πέρα και εσύ πεις ότι έχω δύο κλόνους που είναι επικαλυπτόμενοι. Ξεκινείς αυτή τη δουλειά ξανά και ξανά και ξανά και αρχίζεις και ενώνεις με βάση την πιο υπάρχουσα πληροφορία για τους δίκτες αλληλοεπικαλυπτόμενους κλόνους και κάνοντας συναρμολόγηση των κλόνων έχουμε μπι μπι πιάσει τη δικασία της συναρμολόγησης. Κάνοντας συναρμολόγηση των κλόνων φτιάχνεις πια το πρώτο σου κόντιγ, το συναρμολόγημα. Και όταν θα υπάρχουν κενά χρειάζεται να ξαναπάσεις πίσω στους κλόνους εδώ πέρα που έχεις να πάρεις αυτό το κομματάκι που ξέρεις ότι δεν έχεις βρει αλληλοεπικάλυψη με κάποιον άλλο κλόνο, να το πάρεις αυτό το κομματάκι να κάνεις συμβριδισμό εδώ πέρα να βρεις κάποιους κλόνους που είναι εγκαλυπτόμενοι και να τον βάλεις εδώ ώστε να κλείσεις τα κενά σου. Αυτά τα κενά μετά θα μπορέσεις να τα ενώσεις με κάποιον άλλο κόντιγ και να κάνεις αυτό που λέμε περπάτημα επάνω στα χρωμοσώματα. Δηλαδή με αυτόν τον τρόπο σιγά σιγά ξεκινάς από ένα δίκτη, προχωράς, προχωράς, προχωράς, βρίσκεις, λύνεις τα κενά σου και συνεχίσεις και περπατάς επάνω στα χρωμοσώματα. Με αυτόν τον τρόπο θα ενώσεις κόντιγς και θα κάνεις σκαφόλτς και τελικά όταν ενώσεις και τα σκαφόλτ σου, και τελικά θα συναρμολογίσεις τα πάντα στα χρωμοσώματά σου. Αυτό είναι πολύ σημαντικό να καταλάβετε ότι η συναρμολόγηση δεν είναι εύκολη και δημιούνται κενά. Καλώς την Έλσα, θα μας δώσεις ένα 10-15 λεπτά και να τελειώσουμε και μετά ξεκινάς και εσύ. Λοιπόν, αυτή η συναρμολόγηση, οποιαδήποτε συναρμολόγηση θα κάνεις, πάντα θα σου δημιουργεί κενά. Και με βιοπληροφορικές μεθόδους να υπάρχουν συναρμολογίσεις, πάντα θα έχεις κομμάτια τα οποία θα τα έχεις κομματάκια κομματάκια. Είναι πολύ δύσκολο να μπορέσεις να συναρμολογίσεις το γονιδίωμά σου στα πλήρτα χρωμοσώματα. Ακόμα και τώρα, και στο ανθρώπινο γονιδίωμα, υπάρχουν κάποιες περιοχές οι οποίες έχουν μείνει κενές. Γιατί προφανώς είναι επαναλαμβανόμενο DNA εκεί πέρα και δεν ξέρεις ακριβώς την αλληλουχία εκεί. Άρα αυτό που σας μένει από αυτό το μάθημα είναι το πρόβλημα στη συναρμολόγηση που δημιούργεται από τα κενά. Γιατί πάντα θα το δούμε στην πράξη κομμάτια, τα οποία έχεις κομμάτια εδώ, έχεις κομμάτια εδώ, έχεις κομμάτια εδώ, έχεις κομμάτια εδώ. Λέμε να έχεις ενώσει τα μικρότερα κομματάκια σε μεγαλύτερα, αλλά πάλι δεν είσαι σίγουρος πως αυτά τα μεγαλύτερα ενώνεις ακόμα μεγαλύτερα. Και αυτό θα είναι πάντα ένα πρόβλημα και θα το συζητήσουμε. Πώς μπορούμε λίγο να το αντιμετωπίσουμε. Είναι πρόβλημα και βιοπληροφορικό, όχι μόνο πρόβλημα αυτής της ιραρχημένης προσέγγισης. Γιατί εδώ πέρα μιλάμε και ιραρχημένη προσέγγιση. Αυτό δεν θα μπορώ σε αυτή τη διαδικασία γιατί, ας πούμε, εδώ συγκρίνουμε λίγο γιατί είναι πιο καλή τα πλωνεκτήματα και τα μειονεκτήματα της φυς, σε σχέση ας πούμε να το να καθίσεις να χρησιμοποιείς ανάλυσης σύνδεσης. Δεν θέλω να πούμε, είναι πάρα πολλές λεπτομέρειες, δεν θα σας κουράσω, αφήστε το. Να δούμε λίγο τελικά αυτό το οποίο έγινε όμως, ώστε να τον επιτωπίσουμε, γιατί όπως καταλαβαίνετε το προηγούμενο είναι πάρα πολύ δύσκολο. Περιλαμβάνει πάρα πολλές διαφορετικές δουλειές για να μπορέσει να φτάσει το τελικό σου αποτέλεσμα. Καταλαβαίνετε ότι, για παράδειγμα, στην πρώτη προσέγγιση που αναλύσαμε, τι χρειαζόταν βασικά να κάνουμε μια τεχνική, η βρετισμός. Έχει κάτι άλλο? Ένα βρετισμό έκανες όλο και όλο και έβλεπες τα αποτελεσματά σου. Πέρα αυτή η τεχνική χρειάζεται. Τους γενετικούς χάρτες από πιο πριν να έχεις. Με βάση αυτούς τους γενετικούς χάρτες, να κάνεις συμβριδισμούς των δικτών πάνω στους κλόνους. Να ελέγχεις τους κλόνους μεταξύ τους αν επικαλύπτονται. Αφού επικαλύπτονται ή δεν επικαλύπτονται, να ξαναψάξεις πίσω, να πας πίσω στην βιβλιοθήκη σου να ξαναψάξεις άλλους κλόνους. Δηλαδή, θέλεις πολλές διαφορετικές διαδικασίες, για να μπορέσεις να φτάσεις τελικά στο φυσικό σου χάρτη. Πολλές διαδικασίες, σκεφτείτε ότι έχουμε, επαναλαμβάνω, χιλιάδες, εκατοντάδες μπάξι, γιάξη κτλ. Άρα μιλάμε για πάρα πάρα πολλή δουλειά. Οπότε, ναι, μην ξεκινήσανε οι ερευνητές τους γενετικούς χάρτες για να κάνουν φυσικούς χάρτες, αλλά στο δρόμο καταλάβανε πού πάμε. Δηλαδή, έχει τόση πολλή δουλειά, πώς θα τα βγάλουμε πέρα. Και προσπαθήσαν να βρουν διαφορετικούς τρόπους για να το προσεγγίσουνε. Και ο διαφορετικός τρόπος που το προσεγγίσανε, ήτανε φασικά αυτός. Τι χρειάστηκαν, είπανε να το προσεγγίσουμε πιο απλά. Άρα λοιπόν, τι χρησιμοποιήσανε, ένδυμα περιορισμού. Τι είναι το ένδυμα περιορισμού, ναι. Αναγνωρίζω συγκεκριμένες θέσεις και κόβουνε. Για παράδειγμα, έχεις μια αλληλουχία 6.000 βάσεων, αυτό το ένδυμο το νότ κόβει σε κομμάτια 4.000 και 2.000 βάσεων. Αυτό το ένδυμο το equal one κόβει σε 5.000 και σε 1.000 και ούτω καθεξής. Άρα λοιπόν, όταν έχεις και κάνεις μια ηλεκτροφόρηση, έχεις για παράδειγμα, μάλλον όχι, χαζομάρα είπα, νότ κατ σημαίνει δεν έχει κοπή. Άρα λοιπόν, έχουμε αυτό το κομμάτι το οποίο είναι το άκοπο που είναι εδώ πέρα, το equal one προκαλεί κομμάτια 4.000 και 2.000, το hin 3 κομμάτια 5.000 και 1.000 και άμα κάνεις ταυτόχρονα πέψη και με το ένα και με το άλλο θα πάρεις και άλλα με περισσότερα κομματάκια. Και άμα μετά το κάνεις μια ηλεκτροφόρηση, θα δεις το άκοπο το κομμένο με το ένα ένδυμο, το κομμένο με το άλλο ένδυμο, το κομμένο με τη διπλή πέψη. Εντάξει. Άρα λοιπόν, τι ξέρεις, ότι παίρνεις ένα χαρακτηριστικό πρότυπο σε κάθε περίπτωση που είναι χαρακτηριστικό για αυτή την αλληλουχία που έχει τη συγκεκριμένη αλληλουχία και τις συγκεκριμένες μεταλλάξεις. Άρα λοιπόν, αυτό το οποίο προσπαθούσανε να κάνουνε πια οι ερευνητές είναι να ξεμπλέξουνε από όλους τους γενετικούς δείκτες και τη σχετική θέση των δεικτών και τη σχετική απόσταση μεταξύ τους και τίποτα θα κάνουμε. Έχω κλόνους. Κάθε κλόνος έχει μια άλλη συγκεκριμένη αλληλουχία. Άμα τον κόψω τον κάθε κλόνο με ένα συγκεκριμένο ένισμο περιορισμού, τότε προφανώς θα πάρω σταθερά κομμάτια που θα είναι χαρακτηριστικά αυτού του κλόνου. Άμα κόψω αυτό τον κλόνο, ας πούμε, με ένα συγκεκριμένο ένισμο, θα πάρω αυτά τα κομμάτια. Έναν άλλον κλόνο θα τον κόψω, θα πάρω αυτά τα κομμάτια. Άμα τα βάλω δίπλα-δίπλα, τι μπορώ να δω. Μπορώ να ψάξω για κομμάτια που είναι κοινά όταν κόβω τα διαφορετικά κομμάτια με το ίδιο ένισμο. Βλέπετε, για παράδειγμα, σε αυτούς τους δύο κλόνους έχουμε κάποια κομμάτια που είναι κοινά. Αυτό, αυτό και αυτό. Τα κοινά κομμάτια που προκλείπτουν από τις πέψεις μπορεί να αντιστοιχούν στο γεγονός ότι αυτοί οι δύο κλόνοι είναι επικαλειπτόμενοι, όπως βλέπετε εδώ πέρα, οπότε γι' αυτό και παίρνουν τα κοινά τα κομμάτια. Το καταλαβαίνετε? Άμα έχεις ένα κομμάτι, μια περιοχή που είναι κοινή στους δύο κλόνους της βιβλιοθήκης σου, όταν κόψεις με το ενισμό περιορισμό, εφόσον το ενισμό πάντα θα προκαλεί αυτή τη θέση της κοπής, θα πάρεις κάποια κοινά κομμάτια. Και μετά τι χρειάζεται λοιπόν, να κάνω πέψεις και με άλλους κλόνους, και με άλλους κλόνους, να τα ηλεκτροφορήσω όλα αυτά μαζί, δίπλα-δίπλα, για να μπορέσω τελικά με τη βοήθεια ηλεκτρονικών υπολογιστών, να ψάξω αυτά τα κοινά κομμάτια και να βρω τις ελεπικαλείψεις. Πώς φαίνεται αυτό, δείτε λίγο εδώ πέρα. Αυτό είναι το αποτέλεσμα μιας πέψης σε διαφορετικούς κλόνους με κάποιο ενισμό περιορισμού. Τι βλέπετε εδώ, το χάος. Τι χρειαζόταν λοιπόν σε αυτή την περίπτωση, σκανάρισμα με κατάλληλα προγράμματα, και από τη στιγμή που θα γινόταν τα σκαναρίσματα με τα κατάλληλα προγράμματα, θα μετέτρεπε ο υπολογιστής αυτό το πράγμα σε αυτό. Και από τη στιγμή που το έπαιρνες πια αυτό, μετά θα έπρεπε ο υπολογιστής να καθίσει να συγκρίνει κοινά κομμάτια μεταξύ χιλιάδων κλόνων, για να βρει ελεπικαλείψεις. Αλλά, ποιο είναι το καλό στην όλη υπόθεση σε αυτή την προσέγγιση. Ότι εδώ πέρα πια έχουμε να κάνουμε πάλι με μία προσέγγιση. Δεν χρειάζεται να κάνουμε εδώ πέρα για να κάνουμε τους φυσικούς χάρτες και να βρούμε ελεπικαλείψεις. Απλώς πέψι. Ούτε υβριδισμούς, ούτε κοψίματα, ούτε ελεκτροφορήσεις, ούτε ξανά υβριδισμούς, ούτε τίποτα. Είναι απλώς ελεκτροφόρηση. Και να το δούμε λίγο αυτό πώς γινόταν στην πράξη. Αυτό το site έχει πολλές ωραίες πληροφορίες πίπεδο μικρά βίντεο, animation, που μπορείς να δεις, ας πούμε, πληροφορίες για το γονιδίωμά σου, για το ανθρώπινο γονιδίωμα, για τι να κάνουμε χαρτογράφηση στα γονιδιώματα, πληροφορίες σχετικά με τις βιβλιοθήκες, με τις υποκλονοποιήσεις που χρειζόταν να κάνουμε στις βιβλιοθήκες, για το DNA sequencing, για next generation sequencing, με απλά πράγματα. Εμείς αυτό που θέλω να δούμε είναι αυτό το συγκεκριμένο το βιντεάκι, που θα μας βοηθήσει λίγο να το οπτικοποιήσουμε. Τι σημαίνει παίρνω τα κομμάτια, τα κόβω σε μικρότερα, τα ηλεκτροφορώ και τελικά τα βάζω σε μια σειρά για να φτιάξω τις βιβλιοθήκες μου. Δεν έχει ήχο, οπότε έχουμε λοιπόν το γωνιδίωμά μας, παίρνουμε τα κοίταρά μας, βγάζουμε το DNA, το DNA το κόβουμε σε κομμάτια περίπου 200.000 βάσεις. Αυτά τα 200.000 βάσεις τα κομματάκια θα τα βάλουμε σε μπάκς. Το κάθε ένα από αυτά τα μπάκ πρέπει να το βάλουμε σε ξεχωριστό βακτήριο, ώστε να φτιάξουμε τελικά τις βιβλιοθήκες μας, οι οποίες θα πάνε μετά για αλληλούχηση. Τώρα, υποθετικά αυτό που χρειαζόταν να κάνουμε είναι για να μπορέσουμε να πάρουμε ολόκληρο το γωνιδίωμα, θα μπορούσαμε να διαβάσουμε την καθεμία από αυτές τις 200.000 βάσεις και μετά να αντιστοιχίσουμε. Τι γίνεται όμως αυτό είναι πολύ σημαντικό και είναι ακριβώς το πρόβλημα που υπάρχει. Επειδή ακριβώς τα δείγματά μας έχουν πολλά κύτερα και το κάθε κύτερο περιέχει δύο κόπεις του γωνιδιώματος, όταν φτιάχνεις τη βιβλιοθήκη τα μπάκς έχουν κομμάτια από την ίδια περιοχή του γωνιδιώματος. Άρα λοιπόν βλέπετε ότι έχουμε ξεκινήσει εδώ πέρα, έχουμε πολλά αντίγραφα του γωνιδιώματος και όταν θα πας αυτά τα κομμάτια να τα βάλεις μέσα σε μπάκς, υπάρχουν πολλά μπάκς για την ίδια περιοχή του γωνιδιώματος. Είναι αυτό που θέλουμε έτσι κι αλλιώς για να μπορέσουμε να έχουμε πολλά αντίγραφα της ίδης περιοχής να τα διαβάσουμε. Και βλέπεις λοιπόν ότι αυτά τα κομμάτια είναι σπασμένα σε κομμάτια κομμάτια τα οποία αλλοι επικαλείπτονται. Προσπαθούμε λοιπόν, σαν μια πρώτη προσέγγιση, για να μην καθόμαστε να διαβάζουμε κομμάτια χωρίς να ξέρουμε τίποτα τι διαβάζουμε, να βρούμε εκείνους τους κλόνους οι οποίοι υπάρχουν επικάλυψη, οπότε να μην διαβάζουμε τυχαία ώρα στις περιοχές συνέχεια. Άρα λοιπόν θέλουμε να βάλουμε αυτούς τους κλόνους σε μια σειρά, με απλά λόγια να κάνουμε φυσικό χάρτη, ώστε τελικά να διαβάσουμε το γωνιδίωμα με αυτή τη λογική, χρησιμοποιώντας όσο δυνατόν τον ελάχιστο αριθμό βημάτων. Άρα λοιπόν τι μπορούμε να κάνουμε για να χρησιμοποιήσουμε τα ένισμα περιορισμού, θα κόψουμε με ένισμα περιορισμού το DNA μας, θα πάρουμε ένα μοναδικό πρότυπο, το fingerprint που λέμε, το μοριακό αποτύπωμα αυτής της πέψης και αφού κάνουμε την πέψη μας, τη μεταφέρουμε σε ένα τζέλι ελεκτροφόρησης, θα βάλουμε την ελεκτροφόρηση να τρέξει και παίρνουμε μετά το αποτέλεσμα. Τρέχουν. Θα κάνουμε σκανάρισμα σε υπολογιστή, θα πάρουμε ακριβώς τι έχουμε εδώ πέρα και ας εστιάσουμε σε ένα κομμάτι μόνο της ελεκτροφόρησης. Έχουμε τέσσερις κλόνους που τους κόψαμε με το ίδιο ένισμα περιορισμού. Βλέπουμε ότι υπάρχουν κομμάτια, τα οποία είναι κοινά μεταξύ των κλόνων. Δηλαδή μοιράζονται ένα κοινό αποτύπωμα. Ο κλόνος α και ο δ δεν μοιράζεται καθόλου κοινά τμήματα. Άρα τι σου δείχνει αμέσως αυτό αυτό. Αυτό ότι ο κλόνος α και ο δ δεν είναι επικαλειπτόμενος. Ενώ ο κλόνος σε και ο δ έχει πολλά κοινά τμήματα, άρα προφανώς είναι επικαλειπτόμενος. Και ούτω καθεξής. Μετά από εκεί και πέρα θα προσπαθήσει να τα βάλει το software σε έναν τρόπο, να φαίνονται αντιστοιχείες μεταξύ των διαφορετικών τμήματων. Και μετά αυτό το πρότυπο το αναποδογυρίζει, ώστε τελικά να μπορέσει να βρει ποιες είναι επικαλείψεις μεταξύ των κλόνων. Και με αυτόν τον τρόπο βρίσκει για πρώτη φορά ότι για παράδειγμα ο κλόνος δ έχει κομμάτια που τα βρίσκεις και στον δ και στον σε. Άρα όταν θα θέλεις να διαβάσουμε το γωνιδίωμα, δεν χρειάζεται να το διαβάσουμε και από αυτόν τον κλόνο, αλλά μας ακούν αυτή η τρίση κλόνη όλο και όλο για να μπορέσουμε να πάρουμε μια συνεχή επικάλυψη των γωνιδιωμάτων. Αυτό ήταν σημαντικό γιατί σκεφτείτε ότι ναι μην θέλουμε να έχουμε δεκαπλάσια κάλυψη των γωνιδιώματων, αλλά από όλα αυτά δεν θέλουμε να διαβάζουμε και τυχαία, θέλουμε να ξέρουμε τι διαβάζουμε. Και με την ίδια λογική καθόμαστε και μπαίνουμε στη νέα διαδικασία να βρούμε κλόνους οι οποίοι επικαλείπτονται και πετάμε αυτούς που δεν μας χρειάζονται, ώστε να μπορέσουμε τελικά να ενώσουμε τους ελάχιστοι κλόνους για να μπορέσουμε να πάρουμε τελικά το κόντι που μας ενδιαφέρει και να διαβάσουμε αυτή την αλληλουχία. Αυτή η περιοχή αντιστοιχεί σε ένα κομμάτι του γωνιδιώματος με βάση τον ελάχιστο αριθμό αλληλουχημένων κλόνων. Πολλά από αυτά πρέπει να ενωθούνε για να μπορέσουμε τελικά να πάρουμε ολόκληρο το γωνιδίωμα. Είναι πιο εύκολη τεχνική από την προηγούμενη, σίγουρα. Γιατί έχει αρκετούς υπολογιστές και επίσης δεν χρειάζεται να κάνεις πολλά διαφορετικά πειράματα. Μια πεύση ηλεκτροφόρηση. Βέβαια, σκεφτείτε ότι είχαμε να κάνουμε χιλιάδες πεύσεις και χιλιάδες κλόνους. Σκεφτείτε να έχεις δεκαπέντε χιλιάδες, όπως είπαμε, μπάξ, τα οποία θα πρέπει να τα βρεις. Διακόσο οδόντα χιλιάδες μπάξ να κάνεις πεύσεις. Τι να συγκρίνεις με τι? Είναι αρκετά δύσκολο. Γι' αυτό και σε αυτές τις περιπτώσεις δεν κάνανε συνολικά πεύσεις σε όλο το γωνιδίωμα, αλλά τι κάνανε. Εδώ ήτανε που χρησιμοποίησανε... Τι χρειάζεται εδώ πέρα? Η πληροφορία από την πρώτη προσέγγιση. Με αυτόν τον τρόπο, όπως είπαμε τη φύση, είχαμε ήδη μια γενική πληροφορία. Ξέραμε ότι αυτός ο αριθμός από τα 280.000 μπάξ αντιστοιχούν στον χρωμό σωμένα. Και άλλα 15 από τα 280.000 μπάξ αντιστοιχούν στον χρωμό σωμα 2. Οπότε δεν κάνεις σύγκριση όλων των μπάξ μεταξύ τους. Τα ομαδοποιείς σε ένα χρωμό σωμα και μετά τα μοιράζεις. Πάρε εργαστήριο από τη Γερμανία να δουλέψει με το χρωμό σωμα 1. Πάρε εργαστήριο από την Κρήτη να δουλέψει με το χρωμό σωμα 10. Άρα δεν κάνεις συνολική δουλειά σε τα πάντα, το βάζεις λίγο ρεορχημένα. Είναι δυσκολία, επίπονη η διοδικασία, οικονομικά ασύμφορη, πολλές ανθρωπόωρες. Αλλά τότε έτσι μόνο μπορούσαμε να το κάνουμε, γιατί δεν είχαμε άλλες δυνατότητες να μπορούσαμε να το κάνουμε κάπως διαφορετικά. Έγινε κάποια ερώτηση έχετε? Θα συνεχίσουμε κι αύριο με τους φυσικούς χάρτες. |
