| Εισαγωγικά, Μεταθετά στοιχεία στους προκαρυώτες, Μεταθετά στοιχεία στους ευκαρυώτες, Βιολογική σημασία των μεταθετών στοιχείων: Το σημερινό θέμα μας θα είναι τα μεταθετά στοιχεία. Φαντάζω μετά έχετε ακούσει σε διάφορα μαθήματα και εμείς σας τα έχουμε αναφέρει για το περιεχόμενο του γονιδιώμετος, τους τύπους αλληλουχίας που συναντούμε. Σήμερα θα τα δούμε λίγο σε μεγαλύτερο βάθος. Θα μιλήσουμε τόσο για τη δομή τους, όσο για τον τρόπο μετακίνησης τους και για την λειτουργία τους, αν μπορούμε να βρούμε κάποια. Λοιπόν, από το όνομά τους καταλαβαίνουμε τα μεταθτά στοιχεία είναι γενετικά στοιχεία, είναι ακολουθείες DNA, οι οποίες έχουν την ικανότητα να μετακινούνται μέσα στο γονιδίωμα. Το πρώτο όνομα που τους δόθηκε ήταν jumping jeans, τα γονίδια που πηδάνε και μεταφέρονται σε διάφορες θέσεις. Η πρώτη που μίλησε για μεταθητά στοιχεία ήταν η κυρία Μακλίντοκ και μάλιστα πολύ παλιά, στη δεκαετία του 1930. Και καταλαβαίνετε βέβαια ότι ήταν πολύ δύσκολο να πείσει την επιστημονική κοινότητα, ότι όντως υπήρχαν αλληλουχίες οι οποίες δεν είχαν σταθερή θέση μέσα στο γονιδίωμα. Μιλάμε την επόμενη δεκαετία από το 1920 που ο Μόργκαν είχε ξεκινήσει και είχε δουλέψει στη χαρτογράφης των γονιδίων, ιδιαίτερα στη δροσόφυλλα και φυσικά αυτό στηριζόταν στην πεποίθηση ότι οι θέσεις των γονιδίων είναι σταθερές μέσα στο γονιδίωμα. Όταν ήρθε λοιπόν η κυρία Μακλίντοκ, η οποία ήταν και νεαρή εκείνη την εποχή και μίλησε για αλληλουχίες που αλλάζουν θέση, δεν την πήραν και πολύ στα σοβαρά, μπορούμε να πούμε λίγο περιθωριοποιήθηκε στην επιστημονική κοινότητα, ήταν και γυναίκα, ήταν και νεαρή όπως είπαμε, παρόλα αυτά αργότερα όπως θα δούμε δικαιώθηκε. Οι πρώτες ενδείξεις για την ύπαρξη των μεταθετών αλληλουχιών, ήταν από μελέτες που έγιναν στο Καλαμπόκι. Η Μακλίντοκ δούλευε στην κυταρογενετική κυρίως του Καλαμποκιού, μελετούσε τα χρωμοσώματα στο Καλαμπόκι και οι πρώτες παρατηρήσεις που έκανε και τις συνέδεσε με κάποιο κινητό παράγοντα, ήταν κάποιο σπάσιμο που παρατηρούσε πολύ συχνά σε συγκεκριμένη θέση, στο χρωμόσωμα 9 του Καλαμποκιού. Υπήρχε λοιπόν κάποιος τέλεγος, είχε αναγνωρίσει κάποιον παράγοντα, δεν μπορούσε να προσδιορίσει ακριβώς τι ήταν, ο οποίος προκαλούσε σπάσιμο στο σημείο του χρωμοσώματος 9. Επιπλέον στο τέλεγος που είχε αυτήν την ιδιότητα, έκανε και κάποιες άλλες μη συνηθισμένες παρατηρήσεις. Παρατηρούσε πολύ συχνά απενεργοποιήσεις γονιδίων, άρα μεταλλάξεις. Ήταν επανενεργοποιήσεις, άρα γονίδια που ήταν μεταλλαγμένα σε μια γενιά ή σε κάποια κύτταρα, φαίνονταν να επανενεργοποιούνται και συνοδεύονταν αυτή η επανενεργοποίηση από απενεργοποίηση άλλων γονιδίων. Και έβρισκε πολύ συχνά σπέρματα που είχαν σημαντικές παινοτυπικές διαφορές. Φαίνεται ίσως όχι πολύ καθαρά στην εικόνα. Βλέπουμε την πικυλοχρωμία στα σπέρματα του Καλαμποκιού. Να πούμε ότι το είδος, ο άγριος τύπος του Καλαμποκιού που δούλευε, είχε χρώμα μοβ. Δεν είναι αυτό το κίτρινο που ξέρουμε. Άρα εδώ το χρώμα που βλέπετε κίτρινο είναι το μεταλλαγμένο κατά κάποιο τρόπο. Αν μπορείτε να διακρίνετε υπήρχαν και πάρα πολλά σπέρματα τα οποία ήταν πιτσιλωτά. Είχαν μοσαϊκό φαινότυπο όπως λέμε, κίτρινο και μοβ. Μελετώντας το φαινόμενο αυτό παρατήρησε και κάτι άλλο. Αυτή η συχνότητα, πόσο συχνά θα γινόταν αυτά τα σπασίματα στο χρωμόσομα ή επανενεργοποίηση γονιδίων, σχετίζονταν με την παρουσία και ενός άλλου γενετικού παράγοντα. Δεν έφτανε ο πρώτος για να συμβούν όλα αυτά τα γεγονότα, τον οποίο τον ονόμασε AC από το Activator. Ο αρχικός παράγοντας τον είχε ονομάσει DS, disassociation, γιατί είπαμε προκαλούσε το σπάσιμο στο χρωμόσομα. Προσπάθησε να χαρτογραφίσει τις αλληλουχίες αυτές και παρατήρησε ότι άλλαζαν θέσεις, είχαν κάποια σταθερή θέση μέσα στο γονιδίωμα. Έτσι διατύπωσε την πρόταση ότι υπάρχουν αλληλουχίες, γονίδια τα οποία αλλάζουν θέσεις, χοροπηδούν. Το jumping jeans είναι δικό της όρος, χοροπηδούν μέσα στο γονιδίωμα. Το μοντέλο που πρότεινε είχε ως εξής, ότι υπήρχε ένας παράγοντας, ο DS, ο οποίος δεν μπορούσε να μετακινηθεί όταν υπήρχε μόνο αυτός μέσα στο γονιδίωμα. Σε περίπτωση όμως που μέσα στο γονιδίωμα υπήρχε και η αλληλουχία του δεύτερου παράγοντα, του activator όπως είπαμε, τότε μπορούσε να γίνει η μετακίνηση του παράγοντα DS. Και εδώ βέβαια παρουσιάζουμε τη μετακίνηση σε μια συγκεκριμένη θέση, δεν σημαίνει ότι μόνο σε εκείνη τη θέση μπορεί να μετακινηθεί, είναι η θέση που πρώτο παρατηρήθηκε, που προκαλούσε το σπάσιμο στο χρωμό σώμα 9. Και είναι η περιοχή μάλιστα που υπάρχει και το γονίδιο που ελέγχει το χρώμα του σπέρματος στο καλαμπόκι. Έτσι με τη μετακίνηση μπορεί να προκαλούταν απώλεια του χρωμοσοματικού τμήματος με αποτέλεσμα να έχουμε μεταλλαγμένο φαινότυπο, χάνονταν το γονίδιο που δίνει το μπλε χρώμα στα σπέρματα. Ή μπορούσε να μην συμβεί σπάσιμο του χρωμοσώματος αλλά να απενεργοποιηθεί το γονίδιο καθώς με άλλη αλληλουχία εισέρχονταν μέσα σε αυτό. Ενώ συχνά παρατηρούσαμε όπως είδαμε και μερική αποκατάσταση άρα σε κάποια κύτταρα σωματικά πλέον για να έχουμε φαινότυπο μοσαϊκό στα σπέρματα. Μπορούσαμε να έχουμε αυτήν την μερική αποκατάσταση του κανονικού φαινοτύπου και να έχουμε πιτσιλωτά σπέρματα ως φαινότυπο. Μίλησε λοιπόν για στοιχεία τέτοια μεταθετά, αυτόνομα, αυτά που μπορούσαν, είχαν την πληροφορία για την μετακίνηση τόσο του εαυτού τους αλλά και άλλων στοιχείων. Όπως είδαμε το activator μπορούσε να στηρίξει την μετακίνηση του DS παράγωτα, του παράγωτα disassociation. Και υπήρχαν τα στοιχεία όπως το DS τα οποία από μόνα τους δεν μπορούσαν να μετακινηθούν. Η παρουσία όμως των αρχικών στοιχείων, των αυτόνομων μπορούσε να οδηγήσει στην κίνησή τους. Μίλησε λοιπόν για οικογένειες μεταθετών αλληλουχιών, μεταθετών στοιχείων. Όσο περνούσαν τα χρόνια και άλλοι ερευνητές άρχισαν να βρίσκουν τέτοιες ενδείξεις, οι οποίοι επίσης δούλευαν στο καλαμπόκι. Έτσι αναφέρθηκε ένα άλλο σύστημα μεταθετών, το dotted. Ένα τρίτο σύστημα που ονομάστηκε είναι enhancer και inhibitor. Αναφέρονταν όμως όλα στο καλαμπόκι. Άρα οι επιστήμονες άρχισαν να πιστεύουν ότι ίσως τελικά αυτά τα στοιχεία υπάρχουν, αλλά είναι κάποιο ιδιαίτερο χαρακτηριστικό που βρίσκουμε μόνο στο καλαμπόκι. Αρκετά χρόνια αργότερα, στη δεκαετία του 60 πλέον, παρόμοιες παρατηρήσεις τέτοιου είδους στοιχεία βρέθηκαν και στα βακτήρια, στο E. coli, και βέβαια αργότερα σε πολλούς άλλους οργανισμούς, ξεκινώντας από τη δροσόφυλα, τις ζήμες. Και σήμερα γνωρίζουμε ότι η παρουσία των μεταθετών είναι ένα παγκόσμιο φαινόμενο και ότι αποτελούν σημαντικό συστατικό όλων των ιδιωμάτων. Και πολλά πολλά χρόνια αργότερα, 50 χρόνια μετά, η κυρία Μακλίντοκ δικαιώθηκε και τιμήθηκε με το βραβείο Νόμπελ για την συνησφορά της στην επιστήμη. Λοιπόν, ας δούμε τώρα λίγο πιο αναλυτικά τη δομή αυτών των αλληλουχιών. Θα συγκινήσουμε με τα στοιχεία που υπάρχουν σε προκαρυωτικούς οργανισμούς και στη συνέχεια θα περιγράψουμε τα στοιχεία των ευκαρυωτών. Στους προκαρυώτες συναντάμε δύο διαφορετικούς τύπους μεταθετών αλληλουχιών. Οι πιο απλές αλληλουχίες είναι οι βακτυριακές ακολουθίες παρεμβολής, insertion sequences, ονομάζονται στα αγγλικά, IS συμβολίζονται. Ενώ λίγο πιο σύνθετες είναι αλληλουχίες που ονομάζουμε μεταθετώνια, transposons, ή συμβολίζονται με το TN. Οι αλληλουχίες παρεμβολής, οι ΆΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕΕ� Η ανακάλυψη, το πώς παρατηρήθηκαν αυτοίς οι αλληλουχίες, έχει να κάνει με πειράματα σε βακτηριοφάγους. Γνωρίζετε το φαινόμενο της επαγωγής, πώς ένας βακτηριοφάγος μπορεί να εσωματωθεί μέσα στο γωνιδίωμα του βακτηρίου και κάτω από κάποιες συνθήκες να εξέλθει πάλι, να αποκοπεί το γωνιδίωμα του από το βακτηριακό, αλλά πολύ συχνά παρασύρει ή παίρνει κάποιες αλληλουχίες βακτηριακές κατά την έξοδό του από το βακτηριακό γωνιδίωμα. Μελετώντας αυτό το φαινόμενο λοιπόν σε στελέχη βακτηριακά που είχαν λειτουργικό το περώνιο της γαλακτώσης σε σχέση με στελέχη που παρουσίαζαν μεταλλάξεις και δεν ήταν λειτουργικό γαλαμίον στελέχη, παρατήρησαν ότι οι βακτηριοφάγοι που παρέσαιρναν κάτω από την έξοδό τους μέρος του οπερονίου ή το οπερόνιο της γαλακτώσης από τα βακτήρια, είχαν διαφορά στο μέγεθος του γωνιδιώματος εάν το φαινόμενο όλο γινόταν σε στέλεχος που ήταν λειτουργικό το περώνιο σε σχέση με στέλεχος το οποίο δεν ήταν λειτουργικό. Και αυτό που είδαν ήταν ότι το γωνιδίωμα των βακτηριοφάγων οι οποίοι εξέρχονταν από το στέλεχος που δεν ήταν λειτουργικό το περώνιο, είχαν μεγαλύτερο γωνιδίωμα μεγαλύτερο μέγεθος DNA σε σχέση με τους άλλους βακτηριοφάγους. Υπήρχε λοιπόν μια ένθεση στο γωνιδίωμα του βακτηρίου που μεταφέρονταν στη συνέχεια στο βακτηριοφάγο, οι οποίοι ήταν υπεύθυνοι και για τη μη λειτουργικότητα του οπερονίου. Εδώ είναι εικόνες από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο όταν σχηματίζαν ετεροδημεροί. Αποδιέτασαν τα γωνιδιώματα των δύο τύπων βακτηριοφάγων και μετά από ανάμιξη γινόταν επαναδιάταξη. Παρατηρούσαν κάποιες τέτοιες δομές στα ετεροδημεροί, μόρια δηλαδή που ένας κλώνος ήταν από το ένα στέλεχος και ο άλλος από το άλλο. Ενώ ήταν δηλαδή να υπάρχει κάποιο πλεονάζο γενετικό υλικό στο ένα από τα δύο στελέχη, στο στέλεχος που προέρχονταν από το ελαττωματικό στέλεχος βακτηριών. Άρα επίσης απόδειξη ότι έχουμε περισσότερο γενετικό υλικό, κάποια ένθεση σε αυτά τα στελέχη. Οι ενθαίσεις αυτές ονομάστηκαν οι αλληλουχίες παρεμβολής, και οι οποίες τη συνέχεια φάνηκαν ότι είναι μεταθετές αλληλουχίες και μπορούν να κινούνται μέσα στα προκαρυωτικά γωνιδιώματα. Εδώ βλέπουμε κάποια παραδείγματα τη δομή κάποιων τέτοιων αλληλουχιών. Οι αλληλουχίες ονομάζονται με το ΆΙΕΣ και έναν αριθμό 1, 2, 3, 4, 5, το μήκος τους από 700 μέχρι 1200 ίσως βάσεις. Κοινό χαρακτηριστικό όλων των αλληλουχιών είναι ότι στα άκρα τους έχουν λίγες βάσεις 30, 40, 16, κάποια άλλα, που είναι ανάστροφες επαναλήψεις. Οι αλληλουχίες έχουν συγκεκριμένη θέση στόχο που εισάγονται στο γωνιδίωμα, άρα αναγνωρίζουν κάποια αλληλουχία, δεν είναι τελείως τυχαία η είσοδός τους μέσα στο γωνιδίωμα. Και εδώ βλέπουμε τον αριθμό των αντιγράφων που μπορεί να πηκύλει, αλλά γενικά είναι σε χαμηλό επίπεδο, υπάρχουν στα διάφορα στρένση του οικολάη, γύρω στα 10 ίσως και λιγότερα. Εδώ βλέπουμε καλύτερα τη δομή τους. Αυτές είναι οι ανάστροφες επαναλήψεις που υπάρχουν στα άκρα των στοιχείων ΆΙΕΣ. Και στο εσωτερικό υπάρχει ένα γωνίδιο που κωδικοποιεί για μια πρωτεΐνη, η οποία είναι επεύθυνη για τη μετάθεση των αλληλουχιών αυτών ή μεταθετάση, όπως την λέμε. Οι ανάστροφες επαναλήψεις λειτουργούν ως αλληλουχίες αναγνώρισης για να αποκόψει ή μεταθετάσει ολόκληρο το στοιχείο για να γίνει η μετακίνησή του. Ας δούμε τώρα τα μεταθετώνια. Είπαμε είναι λίγο πιο σύνθετα από τις αλληλουχίες παρεμβολής. Και περιέχουν εκτός από τα γωνίδια τα οποία είναι απαραίτητα για τη μετακίνησή τους, περιέχουν και γωνίδια τα οποία δίνουν κάποιες άλλες ιδιότητες και πολύ συχνά βρίσκουμε μέσα σε τέτοια μεταθετώνια γωνίδια ανθεκτικότητα σε αντιβιωτικά. Χωρίζονται σε σύνθετα και απλά μεταθετώνια. Θα δούμε τη δομή και των δυο τύπων. Εδώ είναι δομές που παρατηρήθηκαν σε πλασμίδια τα οποία έφεραν μεταθετώνια. Αυτή η δομή έτσι σα λάσο εγώ θα το έλεγα ονομάστηκε λόλιποπ. Θυμίζει λίγο το λόλιποπ κλίφιτζουρι λέμε εμείς στα ελληνικά και δείχνει ότι υπάρχει συμπληρωματικότητα και πάλι στα άκρα. Αν θεωρήσουμε ότι όλο αυτό το επιπλέον γενετικό υλικό είναι χωριστό από το πλασμίδιο εννοώ επιπλέον. Είναι το μεταθετώνιο βλέπουμε και πάλι υπάρχει συμπληρωματικότητα στα άκρα και σχηματίζονται αυτές οι δομές. Α, εδώ μας το δείχνει και σχηματικά. Τα μεταθετώνια συμβολίζονται με τι εν και πάλι δίνεται κάποιος αριθμός ένα, δυο, τρία. Πολλά από αυτά τα περισσότερα έχουν όπως είπαμε γονίδια σε ανθεκτικότητα σε αντιβιωτικά και κάποια βέβαια έχουν και πολλαπλά γονίδια όχι μόνο ένα. Το μέγεθος τους ποικίλει αρκετά μπορεί να είναι από δύο χιλιάδες μέχρι δεκατέσσερις χιλιάδες. Άρα έχουμε ένα μεγάλο εύρος όπως επίσης και οι αλληλουχίες, οι ανάστροφες επαναλήψεις που έχουν και αυτά στα άκρα τους. Μπορεί να είναι μικρές, 38 βάσεων, αλλά μπορεί να είναι και αρκετά μεγάλες, 1500 βάσεων. Η δομή που είδαμε προηγουμένως αυτό το μεγάλο στέλεγος προφανώς σχηματίζεται σε μεταθετώνια που έχουν μεγάλο μήκος των ανάστροφων επαναλήψεων. Και εδώ βλέπουμε λίγο πιο αναλυτικά τη δομή τους. Τα σύνθετα μεταθετώνια γιατί τα ονομάζουμε σύνθετα. Είπαμε τόσο τα απλά όσο και τα σύνθετα περιέχουν γονίδια που δεν σχετίζονται με τη μετακίνηση. Τα σύνθετα όμως ονομάζονται έτσι γιατί περιέχουν αλληλουχίες παρεμβολής. Η δομή τους είναι κάπως έτσι. Έχουν δηλαδή στα άκρα τους υπάρχουν αλληλουχίες παρεμβολής. Και στο εσωτερικό υπάρχουν υπέρετερο αλληλουχίες, γονίδια για αντιβιωτικά ή άλλα χαρακτηριστικά. Οι αλληλουχίες παρεμβολής μπορεί να είναι διεταγμένες παράλληλα ή σε αντιπαράλληλη διεύθυνση. Να είναι αντικριστά στα άκρα των μεταθετωνίων. Η μεταθετάση, η πρωτεΐνη που θα κάνει τη μετάθεση κωδικοποιείται, παρέχεται από τις αλληλουχίες παρεμβολής. Άρα στην ουσία θα μπορούμε να πούμε ότι τα σύνθετα μεταθετώνια είναι κάποια γονίδια ανθεκτικότητα σε αντιβιωτικά, που περιβάλλονται από δύο αλληλουχίες παρεμβολής και μπορούν σαν σύνολο να μετακινούνται μέσα στο γονιδίωμα. Εδώ πάλι το βλέπουμε. Και βέβαια πέρα από τα γονίδια για ανθεκτικότητα σε αντιβιωτικά μπορούν να έχουν και άλλες αλληλουχίες που δεν σχετίζονται όμως με τη μετάθεση. Η μεταθετάση παρέχεται από τις αλληλουχίες παρεμβολής στα άκρα τους. Στα απλά μεταθετώνια δεν έχουμε αλληλουχίες παρεμβολής. Αυτή είναι η διαφορά μεταξύ σύνθετων και απλών. Έχουν αλληλουχίες για δική τους μεταθετάση και φυσικά γονίδια για ανθεκτικότητα σε αντιβιωτικό, όπως επίσης τα περισσότερα έχουν και γονίδια για μια άλλη πρωτεΐνη που σχετίζεται και αυτή με τη μετάθεση. Ή ρεσολβάση, όπως το λέμε. Έχουν επίσης ανάστροφες επαναλήψεις στα άκρα τους, οι οποίες βέβαια είναι μικρού μήκους. Εδώ βλέπουμε κάποιο πλασμίδιο, το οποίο φέρει διάφορες μεταθετές αλληλουχίες, τόσο αλληλουχίες παρεμβολής, όσο και μεταθετώνια. Θεωρείται ότι η μετακίνηση γονιδίων ανθεκτικότητας μέσω των μεταθετωνίων είναι υπεύθυνη για τη δημιουργία των πλασμιδίων πολλαπλής ανθεκτικότητας, όπως λέμε. Πλασμίδια τα οποία φέρουν πολλά γονίδια ανθεκτικότητας σε πολλά διαφορετικά αντιβιωτικά και φυσικά δημιουργούν προβλήματα στην καταπολέμησή τους. Βλέπετε εδώ πως υπάρχουν μεταθετώνια, όπως είναι το TN10, ένα σύνθετο μεταθετώνιο, έχει αλληλουχίες παρεμβολής στα άκρα. Υπάρχουν απλές αλληλουχίες παρεμβολής, μεταθετώνιο το οποίο είναι μέσα σε ένα άλλο μεταθετώνιο, από εδώ μέχρι εδώ είναι το TN4 και έχει παρεμβληθεί το μεταθετώνιο TN3. Αυτό που μπορούμε να δούμε είναι πως εφόσον υπάρχουν αλληλουχίες παρεμβολής στα άκρα ή ανάστοιχους επαναλήψεις μπορεί η μεγαλύτερο τμήμα της αλληλουχίας να λειτουργήσει ως μεταθετώνια. Θα μπορούσε δηλαδή όλο αυτό το τμήμα να λειτουργήσει σαν ένα μεταθετώνιο και να μεταφερθεί είτε στο χρωμό σώμα είτε σε άλλο πλασμίδιο κάθοντας σε ένα πολύ σύνθετο μεταθετώνιο που έχει πολλά μικρότερα και απλούστερα στο εσωτερικό του. Το πως μετακινούνται οι αλληλουχίες αυτές στα μόρια του γενετικού υλικού. Υπάρχουν δύο τρόποι, ο συντηρητικός όπως ονομάζεται ή στα αγγλικά το λέμε cut and paste. Αποκόπτεται η αλληλουχία από την αρχική θέση και μεταφέρεται σε μια καινούργια και ο αντιγραφικός το copy and paste αντιγράφεται και ένα καινούργιο αντίγραφο μεταφέρεται σε μια καινούργια θέση ενώ το αρχικό παραμένει στην αρχική του θέση. Οποιοςδήποτε κι αν είναι ο μηχανισμός να θυμάστε ότι πάντα έχουμε διπλασιασμό στην θέση που θα γίνει η ένθεση. Όχι στη θέση από την οποία αποκόπτεται αλλά στη θέση που θα ένθεθει έχουμε διπλασιασμό της αλληλουχίας αναγνώρισης γιατί είπαμε δεν είναι εντελώς τυχαία η θέση που θα γίνει η ενσωμάτωσή τους. Η μεταθετάση αναγνωρίζει τις ανάστροφες επαναλήψεις που υπάρχουν στα άκρα για να κάνει την αποκοπή και παράλληλα αναγνωρίζει και τις αλληλουχίες που θα γίνει η ένθεση. Εδώ βλέπουμε σχηματικά τον συντηρητικό τρόπο, έστω ότι αρχικά το μόριο που είχε το μεταθετό παρουσιάζεται με μπλε ήτανε το μαύρο. Κόβονται το μόριο στις περιοχές των ανάστροφων επαναλήψεων και το μόριο δέκτης είναι το πράσινο. Με κόκκινο είναι η θέση αναγνώρισης όπου εκεί κόβεται το μόριο δέκτης για να γίνει η ένθεση του μεταθετού. Γίνεται σαν ανασυνδυασμός κατά κάποιο τρόπο, όχι ακριβώς αποκοπή και κόλλημα είναι μεταξύ των δύο μωρίων. Το μόριο δότης απαλλάσσεται τελείως από την αλληλουχία του μεταθετού, ενώ εδώ έχουμε την προσθήκη στο μόριο δέκτης. Αυτές είναι οι θέσεις αναγνώρισης οι οποίες μένουν μονόκλονες όταν συμβεί η σύνδεση και συμπληρώνονται μετά με πολυμεράσες και γι' αυτό έχουμε διπλασιασμό, όπως είπαμε, τη θέση αναγνώρισης στο μόριο δέκτη. Τώρα έχουμε δύο κόκκινες αλληλουχίες, εκατέρωθεν του μεταθετού που ενθέθηκε. Ο μηχανισμός του αντιγραφικός είναι ίσως λίγο πιο πολύπλοκος. Εδώ έχουμε το μόριο δότη, ανάστροφες επαναλήψεις στα άκρατο, το μόριο δέκτης και πάλι στην αλληλουχία στόχος κόβεται το μόριο αυτό. Έχουμε σπάσιμο και στο μόριο του δότη και δεν αποκόπτονται και οι δύο κλόνοι, όπως είχαμε στο προηγούμενο σύστημα, αλλά γίνεται μια σύνδεση των δύο μωρίων κατά αυτόν τον τρόπο. Σχηματίζεται αυτό που λένε συνενσωμάτωμα, μια περίεργη τέτοια δομή, όπου η μία λυσίδα έχει μεταφερθεί και συνδεθεί με τη μία λυσίδα του μωρίου δέκτη, δότη, δέκτη. Και η άλλη από την άλλη μεριά. Και στη συνέχεια, για να λυθεί αυτή η δομή, γίνεται ανασυνδυασμός. Πρώτα από όλα, συμπληρώνονται τα μονόκλωνα τμήματα, γίνονται δίκλωνα, άρα έχουμε αντιγραφή και παραγωγή δύο αντιγράφων στην ουσία του μεταθετού. Και στη συνέχεια γίνεται ανασυνδυασμός, έτσι ώστε τα δύο μόρια χωρίζουν και έχουμε παραμονή της αλληλουχίας, τόσο στο μωριο δότη, όσο και στο μωριο δέκτη. Εδώ φαίνεται πιο αναλυτικά πώς γίνεται ο διπλασιασμός στη θέση στόχου, γιατί βλέπουμε ότι το κόψιμο στο μωριο που θα δεχτεί το μεταθετό, δεν είναι στο ίδιο σημείο και στις δύο αλυσίδες, θυμίζει λίγο τον τρόπο που κόβουν οι αντωνουκλιάσεις περιορισμού, άρα παραμένουν μονόκλωνα άκρα στους δύο κλόνους, θα έρθει και θα προσθεθεί η αλληλουχία του μεταθετού, είτε ως δίκλωνο τμήμα όπως το είδαμε στον πρώτο μηχανισμό, είτε θα έρθει ο κάθε κλόνος και θα ενωθεί η κάθε αλυσίδα σε διαφορετικό σημείο και θα γίνει η αντιγραφή, και στη συνέχεια θα συμπληρωθούν επίσης και αυτά τα μονόκλωνα τμήματα και θα έχουμε το διπλασιασμό στην θέση στόχος. Καμιά ερώτηση μέχρι εδώ. Περάσουμε τότε στα μεταθετά, στους ευκαριώτες. Εδώ έχουμε δύο τύπους μεταθετών, είναι τα DNA μεταθετώνια, που μοιάζουν σε πολλά σημεία με τα μεταθετά που βρίσκουμε στους προκαριώτες. Και υπάρχει και ένας διαφορετικός τύπος, τα ρέτρο μεταθετώνια, μεταθετές αλληλουχίες, οι οποίες μεταφέρονται μέσω ενδιάμεσου μορίου RNA. Και χωρίζονται περιτέρως σε δύο πάλι τύπους ρέτρο μεταθετωνίων, αυτά που φέρουν long, μακριές, τελικές επαναλήψεις στα άκρα τους και αυτά που δεν φέρουν τέτοιου είδους επαναλήψεις. Και θα δούμε τη διαφορά στην δομή τους και ίσως στην προέλευση τους. Ας δούμε λίγο τα DNA μεταθετώνια. Είπαμε ότι τόσο στην δομή όσο και στον τρόπο μετακίνησης έχουν πολλά κοινά χαρακτηριστικά με τα μεταθετά στοιχεία των προκαριωτών. Ένα τέτοιο μεταθετό στοιχείο ήταν το στοιχείο που πρώτον παρατήρησε η κυρία Μακλίντοκ. Είναι το σύστημα, μιλάμε για οικογένειες μεταθετών, όπως είπαμε, στους ευκαριώτες, καθώς έχουν ευρεθεί αυτόνομα στοιχεία, όπως είπαμε, αυτά που μπορούν να στηρίξουν τη μετακίνηση και στοιχεία που μοιάζουν στην αλληλουχία με τα αυτόνομα, αλλά δεν μπορούν από μόνα τους να μετακινηθούν. Έτσι έχουμε το σύστημα ACDS. Το αυτόνομο στοιχείο έχει μήκος 24.563 βάσεις. Φέρει ανάστροφες επαναλήψεις μικρού μήκους, 11 βάσεων. Η θέση στόχος που αναγνωρίζει είναι 8 μονοβάσεις και κωδικοποιεί την πρωτεΐνη που ελέγχει τη μετακίνησή του. Αντίθετα το στοιχείο DS δεν μπορεί να μετακινηθεί, όπως είπαμε, από μόνο του. Το μέγεθός του μπορεί να επικύλει. Έχει ίδιες επαναλήψεις με το AC και ίδιες θέσεις στόχους. Δεν κωδικοποιώ όμως για την πρωτεΐνη, γιατί συνήθως αυτά τα μη αυτόνομα είναι στοιχεία υλικοί ή μεταλλαγμένα, έτσι ώστε δεν μπορούν να παράγουν λειτουργική τη μεταθετάση. Εδώ φαίνεται και σχηματικά, έχουμε το πλήρες στοιχείο. Έχει όλες τις αλληλουχίες απαραίτητες για τη μετάθεση που είναι κυρίως οι ανάστροφες επαναλήψεις στα άκρα και βέβαια την αλληλουχία για να παραχθεί η πρωτεΐνη της μεταθετάσης. Εδώ βλέπουμε άλλα μέλη της οικογένειας, τα μη αυτόνομα που συνήθως είναι και περισσότερα, καθώς μπορεί να γίνουν πολλές αλλαγές πάνω στο αρχικό, στο πλήρες αντίγραφο. Μπορεί να έχουν ελλείμματα, το συνηθέστερο είναι να έχουν κάποια ελλείμματα στην αλληλουχία, οπότε δεν μπορούν να παράγουν λειτουργική μεταθετάση. Μπορούν όμως να μετακινηθούν, γιατί φέρουν τις ανάστροφες επαναλήψεις, που είναι τα σημεία που αναγνωρίζει η μεταθετάση, για να κάνει τη μετακίνηση του στοιχείου. Άλλα πολύ γνωστά DNA μεταθετώνια είναι τα στοιχεία P. Δεν ξέρω αν τα έχετε ακούσει ποτέ, τα P-elements στη δροσόφυλα. Και εδώ έχουμε πάλι οικογένεια, τα πλήρη και τα ελαττωματικά. Τα πλήρη έχουν μέγεθος περίπου 3.000 βάσεις, 2.900. Τα ίδια δομή, ανάστροφες επαναλήψεις μικρού μεγέθους, κωδικοποιούν για τη μεταθετάση. Και εδώ βλέπουμε τη δομή του σχηματικά. Στην περίπτωση των στοιχείων P έχουμε συμβαίνει και εναλλακτικό μάτισμα, έτσι ώστε να έχουμε διαφορετικά μετάγραφα, τα οποία παράγουν πέρα από τη μεταθετάση. Τα π στοιχεία παράγουν και μία πρωτεΐνη που μπλοκάρει, περιορίζει την μετακίνησή τους. Έχουν τον εναστολέα της μετάθεσης. Επίσης, χαρακτηριστικό τους είναι ότι μετακινούνται μόνο στα γενετικά κύτταρα και όχι στα σωματικά. Τα ελπί στοιχεία, πάλι τα μη αυτόνομα, είναι κάποιες ελπίς αλληλουχίες, που μετακινούνται μόνο όταν υπάρχουν τα αυτόνομα π έλεμεν, η πλήρης αλληλουχία, που μπορεί να παράγει τη μεταθετάση. Τα π στοιχεία έγιναν αρκετά γνωστά, καθώς υπάρχουν ένα φαινόμενο υβριδιακής δυσγέννησης. Τι εννοούμε υβριδιακή δυσγέννηση? Με διασταύρωση συγκεκριμένων στελεχών παράγονταν απόγονοι, οι οποίοι παρουσίαζαν διάφορα προβλήματα. Συγκεκριμένα είχαν προβλήματα γονιμότητας, ήταν ιηστήρα ή παρουσίαζαν πολλές μεταλλάξεις στους απογόνους τους. Πώς παρατηρήθηκε το φαινόμενο αυτό? Όταν διασταύρωναν κάποια στελέχη άγρια με στελέχη του εργαστηρίου, παρατηρήθηκε η υβριδιακή δυσγέννηση στη μία από τις δύο αντίστροφες διασταυρώσεις. Έτσι βλέπουμε εδώ ότι όταν είχαμε θηλυκά, τα οποία ήταν εργαστηριακά στελέχη και τα διασταύρωναν με αρσενικά, τα οποία ήταν άγρια, παρόλο που οι απόγονοι έβγαιναν φυσιολογικοί, η F1 γενιά ήταν φυσιολογική, είχε όμως προβλήματα στη ρότητας και εμφανίζονταν πάρα πολλές μεταλλάξεις στην F2 γενιά. Αντίθετα στην αντίστροφη διασταύρωση, όταν το θηλυκό ήταν του άγριος τέλεχος και το αρσενικό εργαστηριακό, δεν παρατηρώταν κανένα πρόβλημα. Αυτό φυσικά προκάλεσε το ενδιαφέρον όταν πρώτο παρατηρήθηκε. Στη συνέχεια διαπιστώθηκε ότι η παρουσία των π. μεταθετών ήταν αυτή που δημιουργούσε το πρόβλημα και ότι π. μεταθετά, να πούμε ότι αυτή η οικογένεια μεταθετών στη Δροσόφυλλα άρχισε να εξαπλώνεται στους πληθυσμούς της Δροσόφυλλας μετά τη δεκαετία του 50. Είναι πολύ πρόσφατα στοιχεία που έχουν εισέλθει στο γονιδίωμα της Δροσόφυλλα. Ενώ τα στελέχη τα εργαστηριακά επειδή είχαν απομονωθεί από παλαιότερα, από το 10, από το 20, ήταν όλα στελέχη τα οποία δεν είχαν π. στοιχεία. Διασταυρώνοντας τώρα θηλυκά εργαστηριακά που δεν φέρουν π. με αρσενικά που φέραν π. στοιχεία, στην ουσία γινόταν η μετακίνηση των στοιχείων αυτών οι οποίοι προκαλούσε τα προβλήματα της μεταλλάξης στην F2 γενιά. Γιατί στην αντίστροφη διασταύρωση δεν είχαμε όμως τέτοιο φαινόμενο, όταν τα θηλυκά ήταν άτομα τα οποία φέραν π. στοιχεία. Γιατί είπαμε ότι τα π. μπορούν πέρα από την μεταθετάση να κωδικοποιήσουν και τον ανεστολέα της μετάθεσης. Στα οάρια λοιπόν των θηλυκών ατόμων που φέραν π. υπήρχε ο καταστολέας, ο αναστολέας της μετάθεσης στο κηταρόπλασμα και παρεμπόδιζε τη μετακίνηση των στοιχείων. Βρίσκεται στα εργαστηριακά στελέχη δεν υπήρχε κάτι τέτοιο, οπότε τα π. που εισέρχονταν στο γωνιδίωμα μέσω του αρσενικού, μπορούσαν να μετακινηθούν. Η μετακίνηση στον π. είπαμε γίνεται μόνο στα γενετικά κύταρα. Άρα όλες οι μετακινήσεις γίνονταν στα κύταρα των απογόνων αυτής της διασταύρωσης, στα γενετικά, στη γενετική σειρά και τα αποτελέσματά της. Οι απογόνοι της ΕΦΕΝΑ ήταν φυσιολογικοί, αλλά είχαν προβλήματα στα γαμητικά κύταρα που παρήγαγαν, γι' αυτό στην ΕΦΔ παρουσιάζεσαν πάρα πολλές μεταλλάξεις ή και τα ίδια τα άτομα της ΕΦΕΝΑ παρουσίαζαν στηρότητα. Ένας λόγος που είναι αρκετά γνωστά τα στοιχεία π. είναι γιατί χρησιμοποιήθηκαν, ήταν από τα πρώτα συστήματα που αναπτύχθηκαν για μετασχηματισμό στα έντομα, για να μεταφέρουμε ξένα γονίδια σε έντομα. Χρησιμοποιήθηκαν λοιπόν όσο χήματα, εθέτοντας κάποια ξένα γονίδια στο εσωτερικό τους, για να μπορούν να μεταφέρουν, να τα εισάγουν αυτά τελικά στο γονιδίωμα των εντόμων και να μετασχηματίσουμε όπως λέμε τα έντομα. Εδώ φαίνεται λίγο η διαδικασία που ακαλουλουθήθηκε, το π transformation στην δροσόφυλλα φυσικά αναπτύχθηκε, εφαρμόζεται σε έμβρια δροσόφυλλα, στην οποία προσθήθονται δύο τύπου με ένεση εισάγονται μέσα στο έμβριο, δύο τύπου πλασμίδια. Ένα πλασμίδιο βοηθητικό όπως λέγεται, το οποίο φέρει την αλληλουχία του π στοιχείου, μπορεί να κωδικοποιήσει μεταθετάση και ένα πλασμίδιο στο οποίο έχει ένα ελαττωματικό π στοιχείο και στην περίπτωση εδώ στο παράδειγμα μας δείχνει ότι έχει ένα γονίδιο για το χρώμα των ματιών, να δώσει το φυσιολογικό χρώμα ματιών. Αν χρησιμοποιήσουμε λοιπόν έμβρια τα οποία από ένα στέλεχο, στο οποίο είναι μεταλλαγμένο για το συγκεκριμένο γονίδιο, για το χρώμα των ματιών, γίνει η έναιση με τα δύο αυτά πλασμίδια. Οι απόγονοι στο φαινότυπο τους δεν θα έχουν κάποιο αποτέλεσμα. Εκεί που στοχεύουμε είναι να εσωματωθεί το φυσιολογικό γονίδιο στα γενετικά κύτταρα του εμβρίου αυτού, οπότε θα φανεί στη συνέχεια στους απογόνους. Πώς θα γίνει η ενσωμάτωση με τη μεταθετάση που παράγει το π στοιχείο. Στοχεύουμε στο να γίνει η μετακίνηση αυτής της αλληλουχίας από αυτό το πλασμίδιο στο γονιδίωμα, πλέον σε κάποια θέση, στο γονιδίωμα των γενετικών κυτάρων, των εμβρίων αυτών. Εδώ το πλασμίδιο έχει μόνο τις απαραίτητες αλληλουχίες του για να μετακινηθεί, είναι οι ακραίες επαναλήψεις, τα inverted repeats που πρέπει να αναγνωρίσει η μεταθετάση, για να μπορέσει να το εσωματώσει στα κύτταρα των εμβρίων. Βέβαια καταλαβαίνετε ότι είναι λίγο τυχαίο το αν θα συμβεί και φυσικά και σε ποια θέση θα εσωματωθεί, μπορεί ακόμα να προκαλέσει και προβλήματα. Παρ' όλα αυτά, μέσα σε ένα μεγάλο αριθμό τέτοιων πειραμάτων και εμβρίων που θα διαχειριστούν με αυτόν τον τρόπο, θα υπάρχουν και έμβρυα που επιτυχάνεται η εσωμάτωση και πιθανό σε θέση που δεν δημιουργεί περαιτέρω πρόβλημα. Και βυσικά είπαμε το αποτέλεσμα δεν θα φανεί στο ίδιο το έμβριο το οποίο έχουμε μετασχηματίσει, αλλά εφόσον έχει εσωματωθεί στα γενετικά του κύτταρα, θα φανεί στους απογόνους των εντόμων αυτών. Ένα πρόβλημα μπορεί να προκύψει, εδώ εφόσον βάζουμε και πι στοιχείο, δεν θα μπορούσε και το ολόκληρο, το λειτουργικό το πι στοιχείο να ενθεθεί και αυτό μέσα στο γονιδίωμα. Και στην περίπτωση αυτή βέβαια μετά θα έχουμε πολλές μεταλλάξεις και πιθανόντα πολλά προβλήματα στο γονιδίωμα. Αυτό που δεν φαίνεται αρκετά καλά εδώ είναι ότι το συγκεκριμένο πι μπορεί να παράγει μεταθετάση, αλλά έχει προβλήματα, έχει μη σωστές αλληλουχίες, τις ανάστροφες επαναλήψεις, έτσι ώστε το ίδιο να μην μπορεί να μετατεθεί. Η ίδια αλληλουχία δεν μπορεί να μετακινηθεί, παράγει όμως τη μεταθετάση για να γίνει μετακίνηση της άλλης αλληλουχίας και με αυτόν τον τρόπο μπορούμε να ενθέσουμε διάφορα γονίδια στα έντομα στη δροσόφυλλα. Μη θα σίγουρα έχουν αναπτυχθεί και άλλα συστήματα, αλλά κατά βάση τα συστήματα μετασχηματισμού των εντόμων στηρίζονται στη χρήση μεταθετών στοιχείων. Ας δούμε τώρα την άλλη κατηγορία μεταθετών που συναντούμε στους ευκαριώτες, τα οποία είναι τα ρέτρομεταθετών. Το κοινό χαρακτηριστικό τους είναι ότι μεταφέρονται, μετακινούνται μέσω ενός ενδιάμεσου σταδίου RNA και ανάστοφης μεταγραφής. Υπάρχουν δύο τύποι, όπως είπαμε. Τα πιο γνωστά ίσως είναι τα LTR ρέτρομεταθετώνια, ρέτρομεταθετώνια που έχουν long terminal repeats, μακριές τελικές επαναλήψεις στα άκρα τους. Αυτό που έχει ενδιαφέρον είναι ότι παρουσιάζουν σημαντικές ομοιότητες στη δομή με τους ρέτροοιους. Ρέτροοι, ξέρετε ότι είναι οι RNAοι, οι οποίοι εισέρχονται στο κύταρο, παράγουν την ανάστοφη μεταγραφάση, παράγουν DNA δίκλωνο μέσω της ανάστοφης μεταγραφής και ενσωματώνονται στο γωνιδείωμα των ευκαριωτών. Εδώ βλέπουμε δομή ενός ρέτροοιου με τα γωνίδια που περιέχει, πρωτεΐνη που παίζει ρόλο στην ορή μας του RNA, την ανάστοφη μεταγραφάση, πολυμεράση, πρωτεΐνη που σχετίζεται και καθοδηγεί την ενσωμάτωση του DNA στο γωνιδείωμα και κάποια γωνίδια για την παραγωγή μετά των πρωτεϊνών και του φακέλου του ίου, καθώς στην μόλυνση μετά αποκόπτονται και πάλι από το γωνίδιο ή παράγουν καινούργια ιοσομάτια και εξέρχονται από τα κύταρα. Στην περίπτωση των ρέτρο μεταθετών βρίσκουμε πολλές ομοιότητες, άρα βρίσκουμε γωνίδια που μοιάζουν με τον γκάγ, το γωνίδιο για την ενσωμάτωση, το γωνίδιο της ανάστροφης μεταγραφάσης. Δεν είναι ελατωματικές ή δεν υπάρχουν ή είναι πολύ μικρότερες αλληλουχίες που να σχετίζονται με πρωτεΐνες φακέλου για να σχηματίσουν λειτουργική ιοί. Άρα θεωρείται ότι προήλθαν τα στοιχεία αυτά από ρέτρο ιούς οι οποίοι κάποιο τρόπο τροποποιήθηκαν, μεταλλάχτηκαν, χάσαν μέρος της αλληλουχίας τους έτσι ώστε να μην μπορούν πλέον να σχηματίσουν λειτουργικούς ιούς. Μπορούν όμως να υπάρχουν στο γωνιδίμα ως αλληλουχίες που μπορούν να μεταγραφούν, μπορούν να παράγουν DNA με ανάστροφη μεταγραφή. Και έχουν και τις πρωτεΐνες για να ενσωματωθούν μέσα σε άλλη θέση στο γωνιδίωμα. Τα ρέτρο μεταθετώνια υπάρχουν σε διάφορους οργανισμούς. Τα TY είναι γνωστά στοιχεία στην ζύμη και με πείραμα που έγινε με τα μεταθετά αυτά αποδείχτηκε τελικά ότι όντως η μετακίνηση αυτών των στοιχείων γίνεται μέσω μεταγραφής μέσω RNA. Εδώ βλέπουμε κατασκευάστηκε ένα πλασμίδιο το οποίο έφερε ένα ρέτρο μεταθετώνιο της ζύμης με τις τελικές ανάστροφες επαναλήψεις τα LTR και η περιοχή του στο εσωτερικό μάλλον του μεταθετωνίου που προσθέθηκαν ιντρόνια από άλλα γονίδια. Προσθέθηκαν αλληλουχίες δηλαδή ιντρονικές μέσα στην αλληλουχία του μεταθετού αυτού και προσθέθηκε και προαγωγεία στις γαλακτώσεις για να έχουμε έναν τρόπο να επάγουμε την έκφραση. Εφόσον ενσωματώθηκαν ή μολύνθηκαν κύταρα με την συγκεκριμένη κατασκευή, προσθέοντας γαλακτώση μπορούμε να επάγουμε την έκφραση του κόνστρακτ αυτού, είχαμε η παραγωγή μεταγραφήματος και στη συνέχεια στο γονιδίωμα των κυτάρων εντοπίστηκαν αυτές οι αλληλουχίες, εντοπίστηκαν θέσεις που είχε ενθεθεί αυτή η αλληλουχία που είχαμε κατασκευάσει, στην οποία όμως δεν υπήρχε μέσα το ιντρόνιο. Άρα, οι θέσεις που ενσωματώθηκε αυτή η αλληλουχία δεν περιείχαν το ιντρόνιο, το οποίο αμέσως μας λέει ότι η μετακίνηση δεν έγινε σε επίπεδο DNA, με κάποιο τρόπο να αποκοπεί αυτούση αυτή η αλληλουχία για να ενθεθεί στο γονιδίωμα, αλλά έγινε πρώτα η μεταγραφή, έγινε η επεξεργασία του RNA, η αποκοπή των ιντρονίων και στη συνέχεια προφανώς η ανάστορφη μεταγραφή σε DNA και η ένθεση του μέσα στο γονιδίωμα της ζύμης. Εδώ βλέπουμε λίγο σχηματικά το μηχανισμό μετακίνησης. Υπάρχουν πάλι θέσεις, στόχοι για την είσοδο ενός ρετρομεταθετωνίου μέσα στο γονιδιωματικό DNA. Είναι τη μεταγραφή. Συνήθως υποκινητές για τη μεταγραφή βρίσκονται στις επαναλήψεις, στις ακρές επαναλήψεις αυτών των στοιχείων. Η μεταγραφή μετάφραση για να έχουμε την παραγωγή της ανάστορφης μεταγραφάσης και των πρωιτεϊνών που θα κάνουν την ενσωμάτωση μέσα στο γονιδίωμα εφόσον γίνεται η παραγωγή αυτών των εζήμων. Στη συνέχεια η ανάστορφη μεταγραφή παραγωγή δίκλων ουμωρίου, σπάσιμο του γονιδιωματικού DNA στις θέσεις που υπάρχει η αλληλουχία ή σε κάποιες θέσεις που υπάρχει η αλληλουχία στόχος και πάλι βλέπουμε το κόψιμο γίνεται όπως και στις ενδονοκλιάσεις περιορισμού, παράγονται μονόκλων άκρα. Ίσοδος του δίκλωνο αντιγράφου που έχει παραχθεί στη θέση εκείνη, σύνδεση λοιπόν με το μόριο αυτό και συμπλήρωση των μονόκλωνων περιοχών και αποκατάσταση έτσι της δίκλωνης δομής. Και πάλι έχουμε διπλασιασμό της αλληλουχίας που γίνεται η ένθεση της αναγνώρισης στόχου. Παραδείγματα τέτοιων στοιχείων, ήδη αναφέραμε τα στοιχεία TY στην ζύμη, το μήκος τους γύρω στις 6.000 βάσεις, οι επαναλήψεις, οι long είναι γύρω στις 300-400 βάσεις τα στοιχεία αυτά. Δεν είναι ανάστροφες όπως είδαμε στα DNA μεταθετά στοιχεία, έχουν την ίδια κατεύθυνση, φαίνεται και εδώ με τα βέλη. Και για τα συγκεκριμένα ο ρυθμός στο γονιδείο μας, στα διάφορας τελέχης γίνημης είναι περίπου στα 35 αντίγραφα. Σε πάρα πολλούς οργανισμούς έχουν ευρεθεί ρέτρο μεταθετώνια. Στη δροσόφυλλα έχουμε ένα άλλο παράδειγμα, τα κόπια στοιχεία είναι επίσης αρκετά μελετημένα και γνωστά. Το μέγεθος τους περίπου στο ίδιο επίπεδο, 5.000 βάσεις, γύρω στις 300 οι επαναλήψεις στα άκρα, ενώ τα αντίγραφα στο γονιδείο με τη δροσόφυλλα μπορεί να είναι πολύ περισσότερο. Σκεφτούμε βέβαια ότι και το γονιδείο με τη δροσόφυλλα είναι πολύ μαγαλύτερο από τις ζήμεις, άρα μπορεί να φτάσει και τα 100. Υπάρχουν βέβαια και εδώ οικογένειες, οργανώνονται αυτές οι αλληλουχίες σε οικογένειες, με βάση την ομολογία τους, την ομολογία στις επαναλήψεις στα άκρα ή στην αναγνώριση θέσης στόχου. Και σήμερα στη δροσόφυλλα έχουν βρεθεί περίπου 7 copy-alike, έτσι λέγονται, με παρόμοια λοιπόν δομή και οργάνωση, μεταθετά στοιχεία. Στον άνθρωπο επίσης έχουν βρεθεί ρετρομεταθετά. Εδώ βλέπουμε συνολικά μεταθετά που υπάρχουν στο γονιδείομα του ανθρώπου και είναι εντυπωσιακό ότι σχεδόν το 50 και λίγο παραπάνω από το 50% του γονιδειώματος μας αποτελείται από αλληλουχίες μεταθετών στοιχείων. Εδώ κάτω είναι τα DNA μεταθετά, τα οποία αποτελούν το μικρότερο ποσοστό στη σχέση με τις υπόλοιπες μεταθετές αλληλουχής, γύρω στο 3% του γονιδειώματος αποτελείται από DNA μεταθετά, τα οποία πάρκουν σε μεγάλο αριθμό αντιγράφων, 1000 αντίγραφων αυτόν, τα περισσότερα βέβαια είναι τα μη αυτόνομα που δεν μετακινούνται. Για τα ρετρομεταθετώνια που μιλήσαμε μέχρι τώρα, τα LTR όπως είπαμε μεταθετώνια, το ποσοστό περίπου είναι 8% του γονιδειώματος μας αποτελείται από τέτοιες αλληλουχίες, αντίγραφα 450.000 και ίσως και περισσότερα. Και το μεγαλύτερο βέβαια ποσοστό των μεταθετών, είναι τα άλλου τύπου ρετρομεταθετώνια που αναφέρουμε, αυτά που δεν έχουν LTR, τα μη LTR ρετρομεταθετώνια, τα οποία, χαρακτηριστικό κοινό τους, είναι η παρουσία πολυαίοι στο τέλος της αλληλουχίας τους. Το οποίο αμέσως παραπέμπει στο ότι και η μετακίνηση αυτών γίνεται μέσω RNA, καθώς προφανώς είναι mRNA η μόρια που είχαν την πολυαίη ουρά, τα οποία έγιναν ανάστροφα, μεταγράφηκαν ανάστροφα σε DNA και στη συνέχεια εισήλθαν στο γονιδίωμα. Και περιέχουν γονίδια στο εσωτερικό τους, τα οποία κωδικοποιούν για τα έζυματα που είναι απαραίτητα για την μετακίνηση. Και εδώ πάλι τα αυτόνομα, τα πλήρη και πάρα πολλά μη αυτόνομα, μικρές τέτοιες αλληλουχίες, μέχρι και 1,5 εκατομμύριο αντίγραφα τέτοιων αλληλουχιών στο γονιδίωμα και ανταθρήσουμε τα lines, έτσι ονομάζονται, είναι τα long dispersed sequences και τα short, οι μικρές μη αυτόνομες, κάνουν γύρω στο 35% του γονιδιώματος αποτελείται από τέτοιου είδους αλληλουχίες. Αν έχουμε 34 και 8, 42 και 3, 45, λίγο κάτω από το 50% του γονιδιώματος μας, είναι μεταθετά στοιχεία. Εδώ νομίζω τα είπαμε τα χαρακτηριστικά των lines και των signs, των μη LTR ρέτρομεταθετωνίων. Δεν έχουν τελικές επαναλήψεις, αυτό δεν είπαμε. Είναι ένα χαρακτηριστικό που τα διαχωρίζει από όλα τα υπόλοιπα μεταθετά. Έχουν όμως το τελικό τμήμα με επαναλήψεις της Αδενίνης. Υπάρχουν σε χιλιάδες αντίγραφα, μόνο το ενός τύπου εδώ περιγράφει το L1, το οποίο αποτελεί από μόνο του το 5% του γονιδιώματος του ανθρώπου. Και η πιο γνωστή ίσως διάσημο sign, μικρή τέτοιου τύπου αλληλουχία, είναι η οικογένεια Άλλου, όπου φαντάζομαι την έχετε ακούσει με πολύ μικρό μέγεθος. Παρόλα αυτά είναι τόσο μεγάλος ο αριθμός των αντιγράφων αυτής της αλληλουχίας, όπως που φτάνει μέχρι και το 10% του γονιδιώματος από αλληλουχίες Άλλο. Ένα ερώτημα, πολύ σημαντικό σε σχέση με τα μεταθετά, είναι η βιολογική σημασία τους. Για ποιο λόγο υπάρχουν μέσα στους οργανισμούς, αν να έχουν κάποια λειτουργία και είναι απαραίτητα για τη ζωή. Αυτό που είχαν χαρακτηριστεί ως εγωιστικό DNA, δεν φαίνεται να έχουν κάποια φυσιολογική λειτουργία, δεν είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική ανάπτυξη των οργανισμών, ή τουλάχιστον δεν έχει αποδειχτεί κάτι τέτοιο, γι' αυτό και ονομάστηκαν ως εγωιστικό DNA αλληλουχίες, όσον είχαν τον τρόπο να πολλαπλασιάζονται, κατά κάποιον τρόπο παρασιτούν, θα μπορούσαμε να πούμε, μέσα στο γονιδείωμα και αυξάνουν τα αντίγραφά τους και μετακινούνται μέσα σε αυτό. Αυτό βέβαια που ισχύει και ίσως δεν πρέπει να παραβλέψουμε, είναι ότι η ύπαρξη των μεταθετών στοιχείων είναι πηγή αύξησης της γενετικής αλλαγής και της μικυλότητας. Δίνει πλαστικότητα κατά κάποιον τρόπο στο γονιδείωμα, μπορούν να προκαλέσουν σημαντικές αλλαγές και ενώ ξέρουμε ότι συνήθως η αλλαγή είναι απόκλειση από το φυσιολογικό και μάλλον είναι άσχημη για τον οργανισμό, πολλές φορές αποδεικνύεται και χρήσιμη ανάλογα με τις συνθήκες φυσικά και τη δράση της φυσικής επιλογής. Πιστεύετε λοιπόν ότι τα γονιδειώματα όπως έχουν εξελιχθεί και όπως τα μελετάμε σήμερα, έχουν εξελιχθεί με σημαντικό ρόλο των μεταθετών στοιχείων μέσα σε αυτά. Καταλαβαίνετε νομίζω εύκολα ότι η μετακίνηση αλληλουχιών μέσα στο γονιδείωμα μπορεί να προκαλέσει μεταλλάξεις. Το πιο απλό το είδαμε με το πρώτο παράδειγμα με τα πειράματα της McLeanDoc στο Καλαμπόκι, πως η είσοδος μιας αλληλουχίας μέσα σε μια κωδικοποιούσα περιοχή μπορεί να διακόψει την παραγωγή του προϊόντος ή να προκύψουν εναλλακτικά προϊόντα, πάντως σίγουρα θα έχουμε απώλεια ή τροποποίηση της λειτουργίας του συγκεκριμένου γονιδείου. Μπορούν όμως να ενθεθούν σε κάποια ρυθμιστική περιοχή και αυτό μπορεί να έχει σημαντικές συνέπειες καθώς μπορεί να τροποποίησει την έκφραση της συγκεκριμένης αλληλουχίας με σίγουρα αποτελέσματα στη λειτουργία του οργανισμού. Ένα έτσι εντυπωσιακό παράδειγμα έχουμε από τη Δροσόφυλλα. Εδώ είναι μία μικρή περιοχή που εδράζεται το γονίδιο για το χρώμα των ματιών στη Δροσόφυλλα. Ξέρετε ότι έχουμε πάρα πολλά μεταλλάγματα όσον αφορά το χρώμα, άσπρα, ροζ, βερικοκύρωδα, κοινή, καφέ, διάφορες αποχρώσεις και έχει δειχτεί αναλύοντας την περιοχή ότι οι περισσότερες αυτές μεταλλάξεις οφείλονται στην παρουσία και στην είσοδο μεταθετών στοιχείων. Μέσα στο γονίδιο, το γονίδιο είναι το white jean. Παραπλανεί το όνομα πάντα, παίρνει το όνομα της μετάλλαξης, τα άσπρα μάτια. Στην ουσία είναι ο γονίδιος που κοδικοποιεί για την χρωστική των ματιών της Δροσόφυλλα και βλέπετε σε μία μικρή περιοχή, αυτά είναι λίγες χιλιάδες βάσεις, πόσα μεταθετά στοιχεία έχουν εντοπιστεί σε διάφορα στελέχη βέβαια, δεν είναι όλα στο ίδιο στέλεχος. Υπάρχουν διάφορα σκόπια και άλλου τύπου, P-element στο white locust και κάποια άλλα τα οποία τα περισσότερα είναι ρετρο μεταθετώνια και τα DOC είναι ρετρο μεταθετώνια. Άλλο παράδειγμα μεταλλάξεων, σαφώς υπάρχουν πάρα πολλά, κάποια έτσι λίγο εντυπωσιακό, είσοδος ενός μεταθετού στο πρώτο εξώνιο γονιδίου που ρυθμίζει το σχηματισμό του σώματος, της δομής του σώματος της Δροσόφυλλας, το τραμπαϊθόραξ, οδηγεί στη βαραγωγή μηγών που έχουν δύο τέσσερα φτερά και δύο θωρακικά διαμερίσματα που είμαστε εδώ. Άρα το δίπτερο έγινε τετράπτερο με την είσοδο ενός μεταθετού. Και πέρα από τη Δροσόφυλλα και στον άνθρωπο ακόμα και σήμερα παρατηρούνται νέες μεταθέσεις μεταθετών στοιχείων. Περισσότερες είναι τα science, τα lines, είναι αυτά τα μη LTR μεταθετά και υπάρχουν σύγχρονες σχετικά δημοσιεύσεις ότι παρατηρήθηκε, εκνέουνται νόβο, δεν ήταν κληρονομούμενοι, είσοδο στοιχείου Ελένα στον παράγοντα πήξης, ή επίσης αντίστοιχα είσοδος ενός άλλου στοιχείου στο γονίδιο BRCA2 που ξέρετε ότι σχετίζεται με τον καρκίνο του μαστού, σε άτομα που δεν το κληρονόμησαν από τους γονείς τους. Άρα ακόμα και σήμερα τα μεταθετά στοιχεία μετακινούνται σε πολύ βέβαια μικρό ποσοστό με πολύ μικρή συχνότητα. Βέβαια οι μεταλλάξεις που προκαλούνται δεν είναι απαραίτητα βλαβερές. Εδώ έχουμε ένα παράδειγμα, αυτό που είπαμε και προηγούμενα, ότι κατά πάσα πιθανότητα απόκλειση από το φυσιολογικό είναι κακό, παρ' όλα αυτά κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες μπορεί να δώσει και εξελεκτικό πλέον έκτημα. Εδώ είναι μια μελέτης έντομα που παρουσήθησαν ανθεκτικότητα στα όργανοφωσφορικά εντομοκτόνα και τελικά αποδείχτηκε ότι η ανθεκτικότητα αυτή οφειλόταν στην ίσου δονός μεταθετού του DOC μέσα στο γονίδιο της κοινάσης της Χολίνης που είχε ως αποτέλεσμα να προκύπτουν δύο εναλλακτικά μετάγραφα, τα οποία βοηθούσαν τους οργανισμούς και τους έδιναν ανθεκτικότητα στα εντομοκτόνα και με τον τρόπο αυτό τα αλληλόμορφα που φέραν την ένθεση έχουν εξαπλωθεί ή εξαπλώνονται στους πληθυσμούς των εντόμων. Άρα δεν είναι πάντοτε κακό, παρόλα αυτά είναι πιο σπάνιο να δώσει κάποιο πλέον έκτημα, μια μετάλλαξη σε σχέση με το να δημιουργήσει πρόβλημα. Πέρα όμως από τις μεταλλάξεις τις εντοπισμένες σε συγκεκριμένα γονίδια, τα μεταθετά στοιχεία μπορούν να προάγουν τις χρωμοσοματικές αναδιατάξεις, εφόσον υπάρχουν ομόλογες αλληλουχίες σε διάφορα σημεία στο γονιδίωμα, μπορεί να έχουμε ένα συνδυασμό μεταξύ των αλληλουχιών αυτόν και να προκύπτουν διάφορες χρωμοσοματικές αναδιατάξεις. Εδώ δείχνει για λήματα, για αναστροφές, το βλέπουμε και εδώ, διπλασιασμούς μπορεί να έχουμε μέσω άνισου διασκελισμού μεταξύ ομόλογων αντιγράφων μεταθετών στοιχείων. Νομίζω έχει και ένα παράδειγμα αναστροφής. Εδώ βλέπουμε πάλι γονίδια στην δροσόφυλλα, τα οποία εδώ είναι υποκινητές, που έχουν αντιπαράλληλη διάταξη και την παρουσία δύο στοιχείων DOC, εντρόνια βλέπουμε, δεν είναι σε κάποια κωδικοποιούσα περιοχή των γονιδίων αυτόν. Παρ' όλα αυτά, εάν συμβεί ανασυνδιασμός μεταξύ των δύο αυτών ομόλογων μεταθετών στοιχείων, έχουμε ως αποτέλεσμα να ανταλλαγεί των υποκινητών στην ουσία των δύο γονιδίων, άρα ο υποκινητής του γονιδίου RFD ελέγχει πλέον το γονίδιο αντεναπίντια, δεν είναι πολύ καθαρά εδώ στις τα γράμματα, και το αντίστροφο. Τα γονίδια αυτά είναι επίσης της ομάδας που ελέγχει την κατασκευή του σώματος κατά την ανάπτυξη της δροσόφυλας και βλέπουμε εδώ ότι αυτή η αλλαγή μπορεί να οδηγήσει στο να γίνουν πόδια αντί για κερές στο κεφάλι της δροσόφυλας, αυτά εδώ είναι πόδια, ενώ θα έπρεπε να έχει τα, όχι κερές, αυτά είναι τα μασιτικά συστήματα του εντόμου. Άρα και μέσω χωμοσοματικών αναδιατάξεων μπορούν να προκαλέσουν σημαντικές αλλαγές στη λειτουργία του ατόμου. Μπορούν να έχουν μέσω μεταθετών να συμβούν και μετακινήσεις μεγάλων γονιδιαματικών τμήματων. Το μεταθετό θυμηθείτε λίγο το πλασμίδιο πολλαπλής ανθεκτικότητας που είχαμε δείξει που είχε διάφορες αλληλουχίες μεταθετών και πως κάποια μεταθετά ήταν μέσα σε άλλα και μπορούν μεγάλες περιοχές εφόσον έχουν στα άκρα τους κάποια μεταθετά στοιχεία να μετακινηθούν ως σύνολο. Αυτό μπορεί να γίνει και στους ευκαιριότες σε περίπτωση που είναι σχετικά κοντά, το σχετικά μπορεί να είναι εκατομμύρια βάσεις βέβαια, έστω στην ίδια θέση, στο ίδιο χρωμόσομα. Δύο μεταθετά στοιχεία μπορούν να λειτουργήσουν ως ένα πολύ μεγάλο, υπάρχουν οι θέσεις αλληλουχίες για την αναγνώριση, για τη μετακίνηση από τη μεταθετάση. Με αποτέλεσμα μπορεί όλη αυτή η περιοχή, η ενδιάμεση γονιδιωματική να μετακινηθεί σε κάποια νέα θέση με όποιες επιπτώσεις αυτές για τον οργανισμό. Έτσι λοιπόν βλέπουμε ότι ίσως έχουν κάποια λειτουργία σε ισαγωγικά τα μεταθετά, προσφέρουν μια πλαστικότητα στο γονιδίωμα, τη δυνατότητα αλλαγής. Και έχει παρατηρηθεί ότι στο Καλαμπόκι νομίζω, σε στελέχη που αναπτύσσονται σε περιοχές με δύσκολες περιβαλλοντικές συνθήκες, σε στελέχη αυτά έχει βρεθεί μεγαλύτερη ποσότητα, περισσότερα αντίγραφα μεταθετών στοιχείων και μεγαλύτερη συχνότητα μετακίνησης των μεταθετών μέσα στα γονιδιώματα αυτά. Και πιστεύεται ότι σε ένα περιβαλλοντικό στρες, απότομη αλλαγή των συνθηκών, η δυνατότητα να αναδιατάξεις κατά κάποιο τρόπο το γονιδίωμα, μπορεί να προσφέρει εξελικτικό προσαρμοστικό πλεονέκτημα και να βοηθήσει τον πληθυσμό να αντιμετωπίσει τις συνθήκες αυτές. Παρ' όλα αυτά, άμα το σκεφτούμε, η ποσότητα των μεταθετών που έχουμε σήμερα στα γονιδιώματα είναι τεράστια. Είδαμε για τον άνθρωπο περίπου 50%, στις αλαμάντρες είναι 90%, στο καλαμπόκι, το έχουμε αναφέρει τόσες φορές, περίπου 70% του γονιδιώματος είναι μεταθετά στοιχεία. Αυτό σίγουρα δημιουργεί ένα βάρος στο γονιδίωμα, στα είδη και υπάρχουν οι σκέψεις ότι τόσο πολύ γονιδίωμα, το οποίο δεν φαίνεται να έχει κάποια φυσιολογική λειτουργία και μπορεί να προκαλέσει αλλαγές, πιθανόν να είναι πρόβλημα και πως κατάφερε να παραμείνει κατά τη διάρκεια της εξέλιξης μέσα στα γονιδιώματα και να αυξηθεί σε τέτοιο βαθμό. Άρα πως τελικά μπορέσαν τα μεταθετά και εξαπλώθηκαν τόσο πολύ και έχουμε τέτοιο μεγάλο ποσοστό μεταθετών στα γονιδιώματα. Έχει ενδιαφέρον να δούμε όχι μόνο την ποσότητα αλλά και σε ποιες θέσεις εντοπίζονται τα μεταθετά στοιχεία. Αυτό που βλέπουμε σήμερα, μελετάμε τα γονιδιώματα των οργανισμών είναι σαφώς η κατάσταση που έχει δημιουργηθεί μετά από μακροχρόνια εξέλιξη και βλέπουμε ας πούμε ότι τα μεταθετά δεν εντοπίζονται σε λειτουργικές θέσεις. Σπάνια θα βρεθούν μεταθετά στοιχεία τα οποία όντως να είναι μέσα στα γονίδια. Εδώ είναι το παράδειγμα του γονιδίου που σχετίζεται με την ασθένεια της αλκαπτομουρίας. Ένα μεγάλο γονίδιο, αν εδώ είναι 10.000 βάσεις, είναι γύρω στις 60-70.000 βάσεις, εκτείνεται ολόκληρο το γονίδιο. Και εδώ είναι ο αριθμός και οι τύποι των μεταθετών στοιχείων που υπάρχουν μέσα σε αυτό το γονίδιο. Άλλους, Signs, Lines, LTR, πολλά και διαφορετικά μεταθετά, τα οποία βέβαια όμως αν παρατηρήσετε είναι όλα μέσα στα ιντρόνια του γονιδίου και δεν υπάρχουν μέσα στα εξόνια. Άρα σαφώς έχει λειτουργήσει η επιλογή, έτσι ώστε αυτά που βλέπουμε σήμερα να είναι μεταθετά, τα οποία δεν δημιουργούν λειτουργικά προβλήματα, δεν εντοπίζονται μέσα σε λειτουργικές περιοχές. Όπως επίσης το μεγαλύτερο ποσοστό των αλληλουχιών που υπάρχουν είναι τα μη αυτόνομα, τα οποία δεν μπορούν να μετακινηθούν καθώς έχουν σωρεύσει μεταλλάξεις. Έχουν βρεθεί επίσης, έχουν παρατηρηθεί μηχανισμοί ρύθμισης της κίνησης των μεταθετών από ξενιστές. Για παράδειγμα έχει βρεθεί σε νηματόδις το φαινόμενο του RNA interference, πως μέσω μικρών μωρίων RNA παρεμποδίζεται με τα κίνηση μεταθετών. Άρα έχει ειδικά RNA-Is στους νηματόδις τα οποία μπλοκάρουν την μετακίνηση κάποιων μεταθετών που βρίσκονται σε αυτά. Από την άλλη βλέπουμε ότι και τα μεταθετά, κάποια τύπη μεταθετών που βρίσκουμε έχουν μηχανισμούς αυτοσυγκράτησης της μετακίνησης τους. Βλέπαμε για παράδειγμα τα π μεταθετά που τα ίδια παράγουν τον καταστολέα τους, γιατί αν το σκεφτούμε έτσι λίγο περίεργα, δεν συμφέρει και στο μεταθετό αν θέλει να εξαπλωθεί να σκοτώνει ή να δημιουργεί πρόβλημα να περιορίζει τον πολλαπλασιασμό του ξενιστήτου, του γονιδιώματος μέσα στο οποίο είναι. Σαφώς βέβαια δεν υπάρχει στόχος από μια λιλουχία DNA, αλλά μέσω της εξέλιξης, συνεξέλιξης των γονιδιωμάτων, των μεταθετών, βλέπουμε ότι σήμερα μεγάλη ποσότητα οφείλται στο ότι είναι σε συγκεκριμένες θέσεις, είπαμε μη λειτουργικές, στο ότι υπάρχουν μηχανισμοί είτε από τον ξενιστή, είτε και από τα ίδια τα μεταθετά αυτορύθμισης, να μην έχουμε ανεξέργητη μετακίνηση, μεταθετά που έχουν προτίμηση για ασφαλείς θέσεις, αυτό που λέμε μη λειτουργικές, γι' αυτό πολύ συχνά βρίσκουμε μεταθετά μέσα σε μεταθετά, ή συσσόρευση αυτών σε περιοχές ετεροχρωματινικές. Έχουν παρατηρηθεί, έχουν βρεθεί κάποια στοιχεία τα οποία φαίνεται να έχουν προτίμηση για θέσεις τις οποίες μετατύθενται, τα TY3 τα οποία βρίσκονται κοντά, αλλά όχι μέσα σε TRNA γονίδια, ή άλλο μεταθετό στη δροσόφυλλα το οποίο εμφανίζεται να υπάρχει μόνο μέσα σε ριβοσωμικά γονίδια, το οποίο βέβαια μπορεί να καταστρέφει το γονίδιο, αλλά είναι τόσες χιλιάδες τα αντίγραφα του ριβοσωμικού, οπότε το αποτέλεσμα δεν είναι τόσο δραματικό όσο να ήταν σε κάποιο γονίδιο μοναδικό. Άρα μέσα στην πορεία των χρόνων υπάρχει, αναπτύχθηκαν μηχανισμοί να διατηρείται μια ισορροπία, έτσι ώστε σήμερα να έχουμε γονιδιώματα που μπορούν να λειτουργούν με 90% μεταθετά στοιχεία μέσα σε αυτά. Αυτά ήθελα εγώ να σας πω, δεν ξέρω αν θέλετε κάτι να ρωτήσετε. |
